您當(dāng)前位置：- 嗜冷菌對(duì)牛乳的危害及檢測(cè)控制韓中惠1，黃艾祥1，毛華明2，范江平1，*1．云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 云南昆明 650201，2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 云南昆明 650201摘要：嗜冷菌及其代謝產(chǎn)生的酶是引起原料乳及乳產(chǎn)品發(fā)生酸包、乳清分離等腐敗變質(zhì)的主要原因之一。本文綜述了嗜冷菌的分類(lèi)，分析了牛乳中嗜冷菌的來(lái)源與危害，并介紹了嗜冷菌的檢測(cè)方法及對(duì)嗜冷菌的控制措施。關(guān)鍵詞：嗜冷菌；來(lái)源；危害；檢測(cè)方法；控制措施近幾年來(lái)，我國(guó)的奶類(lèi)總產(chǎn)量增長(zhǎng)迅速，2011年奶類(lèi)總產(chǎn)量達(dá)3825萬(wàn)噸。據(jù)預(yù)計(jì)，未來(lái)5年原料奶產(chǎn)量仍將以高速穩(wěn)步增長(zhǎng)。原料奶營(yíng)養(yǎng)豐富，是微生物的良好培養(yǎng)基，屬高危險(xiǎn)性食品原料。嚴(yán)重污染的原料奶，蛋白質(zhì)和脂肪會(huì)被微生物產(chǎn)生的酶所氧化或水解，奶膠體系統(tǒng)喪失原有的穩(wěn)定性，并產(chǎn)生風(fēng)味缺陷。這樣的奶已無(wú)法經(jīng)受某些加工處理，生產(chǎn)的產(chǎn)品也不再具有乳香味，整體質(zhì)量受到破壞。如果奶中微生物種類(lèi)多、數(shù)量高，直接影響殺菌效果，使奶制品的保質(zhì)期縮短，易引起其腐敗變質(zhì)，傳播疾病，危害人體健康。原料奶中嗜冷菌對(duì)不同的乳制品都會(huì)造成不利的影響，國(guó)外早在20世紀(jì)80年代，在乳品生產(chǎn)過(guò)程中已經(jīng)建立了完善的嗜冷菌檢測(cè)體系。我國(guó)在乳品生產(chǎn)過(guò)程中，對(duì)嗜冷菌的控制還沒(méi)有引起足夠的重視，國(guó)家檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中也尚未有明確的規(guī)定。近年來(lái)由食品衛(wèi)生問(wèn)題而導(dǎo)致的多起消費(fèi)事故，導(dǎo)致人們對(duì)食品的安全性提出了更高的要求。因此，加強(qiáng)對(duì)嗜冷菌的檢測(cè)和控制，有助于提高乳及乳制品的質(zhì)量，保證消費(fèi)者的食用安全性。1.嗜冷菌的定義和分類(lèi)1.1嗜冷菌的定義1887年Forster首次發(fā)現(xiàn)在0℃時(shí)，魚(yú)中仍具有在生長(zhǎng)能力的微生物[1]。1902年Schmidt-Nielsen首次對(duì)該類(lèi)微生物做了定義：能夠在0℃生長(zhǎng)繁殖的微生物稱(chēng)之為嗜冷菌[2]。在微生物學(xué)術(shù)界對(duì)嗜冷菌的定義有很多種。目前在乳制品行業(yè)中，國(guó)際乳品聯(lián)合會(huì)（IDF）對(duì)嗜冷菌的定義是公認(rèn)的。國(guó)際乳品聯(lián)合會(huì)（IDF）定義嗜冷菌為：能夠在7℃及以下能生長(zhǎng)繁殖的微生物為低溫菌；在20℃及以下能生長(zhǎng)繁殖，在10℃-15℃為最適生長(zhǎng)溫度的微生物稱(chēng)為嗜冷菌。由于嗜冷菌長(zhǎng)期生活在低溫條件下，自身形成了一系列適應(yīng)低溫機(jī)制，這一機(jī)制主要表現(xiàn)在細(xì)胞生物膜、細(xì)胞內(nèi)的酶、冷休克蛋白、基因調(diào)控等[3]。1.2嗜冷菌的分類(lèi)嗜冷菌在自然界的分布范圍極其廣泛。在高山上、極地地區(qū)，以及大洋深處嗜冷菌都可以存在；與此同時(shí)，人工制冷設(shè)備冰箱、冷庫(kù)中也大量存在嗜冷菌。很多人將嗜冷菌分為2類(lèi)，1986年Hucker將嗜冷菌進(jìn)行細(xì)分，定義那些只能生活在低溫下且最高生長(zhǎng)溫度不超過(guò)20℃，最適生長(zhǎng)溫度等于或小于15℃，在0℃及以下都可以繁殖生長(zhǎng)的嗜冷菌為專(zhuān)性嗜冷菌(Psychrophile);將最高生長(zhǎng)溫度可以超過(guò)20℃，在0-5℃的環(huán)境中可以生長(zhǎng)，一般生長(zhǎng)溫度范圍在0-35℃的嗜冷菌定義為兼性嗜冷菌(Psychrotroph)[4]。經(jīng)過(guò)研究人員的分離鑒定，目前乳中嗜冷菌的主要種屬有：假單胞桿菌屬(Pseudomonas)、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)、黃桿菌屬(Flarobacterium)、色桿菌屬(Hromobacterium)腸道桿菌屬(Enterbacteriaceae)、微球菌屬(Micricoccus)、鏈球菌屬(Streptococus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)等，其中假單胞桿菌屬(Pseudomonas)中的熒光假單胞菌(P. fluorescens)最為常見(jiàn)[5]。2.牛乳中嗜冷菌的來(lái)源與危害2.1牛乳中嗜冷菌的來(lái)源嗜冷菌最主要來(lái)源于原料乳中。經(jīng)過(guò)巴氏殺菌或者超高溫殺菌等殺菌方式后，牛乳中的嗜冷菌含量極少，無(wú)菌包裝后的牛乳很難再受到外界環(huán)境的污染。因此嗜冷菌最主要存在于原料乳中，也就是說(shuō)牛乳受到嗜冷菌污染的階段在加工前。加工前的牛乳受到嗜冷菌污染來(lái)源主要有以下幾個(gè)方面。2.1.1自然環(huán)境嗜冷菌在自然界中廣泛存在，在采集牛乳時(shí)易受到空氣和水中的嗜冷菌污染。如果是手工擠奶，在擠奶的過(guò)程中牛乳與空氣接觸的機(jī)會(huì)很大，空氣中的嗜冷菌很有可能落入牛乳中；牧區(qū)的條件有限，使用的水多是井水，井水中的嗜冷菌比自來(lái)水的多，牛乳受到井水污染的程度加大。2.1.2擠奶及儲(chǔ)運(yùn)設(shè)備在擠奶器襯內(nèi)表面和冷卻罐中含有嗜冷菌的數(shù)量較多[6]，特別是設(shè)備停車(chē)期間，如果設(shè)備清洗不徹底，嗜冷菌會(huì)大量的繁殖，而造成對(duì)原料奶二次污染。2.1.3奶牛的乳房和乳頭表面蘇景輝等人對(duì)管理一般和管理較好的牧場(chǎng)中的奶牛乳房和乳頭表面進(jìn)行檢測(cè)都發(fā)現(xiàn)有嗜冷菌的存在[6]。2.2嗜冷菌對(duì)牛乳的危害嗜冷菌本身對(duì)牛乳的危害不是很大，因?yàn)榻?jīng)過(guò)殺菌后，牛乳中的嗜冷菌幾乎完全殺滅。這類(lèi)細(xì)菌的大多數(shù)可被巴氏殺菌殺死，但菌體生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的胞外酶（蛋白酶、脂酶）卻具有抗熱性，可以在巴氏消毒乳中保留其酶活性，進(jìn)而因酶的作用影響原料乳和終產(chǎn)品的風(fēng)味和質(zhì)量[7]。對(duì)牛乳造成巨大危害的熱穩(wěn)定性酶類(lèi)物質(zhì)一般分為兩大類(lèi)：一類(lèi)是熱穩(wěn)定性蛋白酶，另一類(lèi)是熱穩(wěn)定性脂肪酶。2.2.1熱穩(wěn)定性蛋白酶對(duì)牛乳的危害原料乳中的對(duì)熱穩(wěn)定性蛋白酶有兩類(lèi)：牛乳自身的纖維蛋白溶酶(胞漿素)和由嗜冷菌產(chǎn)生的耐熱蛋白酶[8]。嗜冷菌產(chǎn)生的蛋白酶為影響乳及乳制品質(zhì)量的主要因素[9]。嗜冷菌產(chǎn)生的耐熱性蛋白酶具有耐高溫性，在殺菌中并不能完全失活，此類(lèi)酶可以水解牛乳中蛋白質(zhì)。方海紅等人將嗜冷菌產(chǎn)生的耐高溫蛋白酶分為三種形式：胞內(nèi)酶、胞壁蛋白酶和胞外蛋白酶[10]。這三種酶經(jīng)高溫處理后仍有較強(qiáng)的復(fù)性能力，沒(méi)有失活的部分蛋白酶，能夠重新恢復(fù)原來(lái)的活性。該殘留的蛋白酶可以分解κ-酪蛋白和α-酪蛋白，造成蛋白質(zhì)失去穩(wěn)定性，蛋白發(fā)生聚集并隨自身重力作用沉于底部，使乳清逐漸析出[11]。同時(shí)該類(lèi)蛋白酶在分解乳中蛋白時(shí)，還會(huì)使牛乳釋放出帶苦味的氨基酸和短肽，并且顏色褐變。此外，在加工過(guò)程中，這些耐熱性蛋白酶還會(huì)造成片式熱交換器的淤塞，對(duì)設(shè)備清理難度加大；嗜冷菌還會(huì)在設(shè)備的表面和膠墊上形成生物膜。2.2.2熱穩(wěn)定性脂肪酶對(duì)牛乳的危害乳中的脂肪酶主要由原料乳的天然脂肪酶和嗜冷菌所產(chǎn)生的脂肪酶兩部分組成[12]。嗜冷菌所產(chǎn)生的脂肪酶具有良好的耐熱性。在經(jīng)138℃處理后，該脂肪酶活力仍能維持原先的一半；1981年Adams發(fā)現(xiàn)假單胞桿菌MC50產(chǎn)生的脂肪酶在100℃時(shí)D值達(dá)到63s[13]；還有其它的研究者發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌產(chǎn)生的熱穩(wěn)定性脂肪酶150℃時(shí)的D值可達(dá)到了290s[14]，可見(jiàn)該酶的耐熱性很強(qiáng)。這些耐熱的脂肪酶可以分解脂肪釋放出游離脂肪，游離出的脂肪能將脂肪球粘合在一起產(chǎn)生脂肪球簇，使牛乳的脂肪上��；脂肪酶還可以對(duì)脂肪球膜進(jìn)行分解，使脂肪球出現(xiàn)聚集發(fā)生脂肪上浮[15]。當(dāng)原料奶中嗜冷菌數(shù)量超過(guò)106 cfu/ml，過(guò)多的蛋白酶和脂肪酶將導(dǎo)致UHT奶制品產(chǎn)生凝塊、發(fā)芽，并產(chǎn)生脂肪氧化味。3.嗜冷菌的檢測(cè)與控制方法3.1嗜冷菌的檢測(cè)方法對(duì)于嗜冷菌的檢測(cè)方法可以大體的分為2大類(lèi)：傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法和與現(xiàn)代技術(shù)結(jié)合法。這些方法仍具有一些局限性，目前尚需研究出省時(shí)、經(jīng)濟(jì)、高效的檢測(cè)方法。3.1.1傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法主要是：IDF Standard 101A對(duì)嗜冷菌培養(yǎng)溫度為4℃-6℃，培養(yǎng)時(shí)間為10d[16]；IDF Standard 132A對(duì)嗜冷菌的培養(yǎng)溫度為21℃，培養(yǎng)時(shí)間為24h[17]。前者的結(jié)果不如后者的準(zhǔn)確，后者比前者檢測(cè)速度快。紀(jì)振杰等通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)法與3M 細(xì)菌總數(shù)測(cè)試紙片法檢測(cè)原料乳中嗜冷菌數(shù)的比較實(shí)驗(yàn)，確定3M 細(xì)菌總數(shù)測(cè)試紙片法為快速、精確的檢測(cè)嗜冷菌數(shù)的方法[18]。3.1.2現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)由于中國(guó)乳品產(chǎn)業(yè)起步晚，所以國(guó)內(nèi)現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用沒(méi)有國(guó)外那么普遍。與現(xiàn)代技術(shù)結(jié)合的檢測(cè)方法主要有rDNA核酸序列、熒光標(biāo)記物[29]、ELISA法[20]、肽核酸探針等。任靜等人通過(guò)對(duì)酶活性的檢測(cè)來(lái)建立嗜冷菌與產(chǎn)物耐熱性脂肪酶的關(guān)系，進(jìn)而得到嗜冷菌數(shù)[21]。由于現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)需要昂貴的儀器設(shè)備和實(shí)驗(yàn)藥品，在乳制品工業(yè)中尚不能普遍使用。3.2嗜冷菌的控制方法嗜冷菌的動(dòng)態(tài)增加與耐熱蛋白酶和耐熱脂肪酶活力變化趨勢(shì)大致相同，對(duì)牛乳的貨架期產(chǎn)生影響[22]。由此可見(jiàn)控制嗜冷菌的數(shù)量和耐熱酶是非常有必要的。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)嗜冷菌的有效抑制方法還報(bào)道的不多，有利用CO2來(lái)進(jìn)行減少嗜冷菌數(shù)量的，有利用化學(xué)殺菌劑的，還有添加金屬離子的。牛乳中嗜冷菌的數(shù)量可以從牛乳加工前和加工過(guò)程兩個(gè)階段采取控制措施。3.2.1牛乳加工前。原料乳中本身含有的嗜冷菌極少，主要是外源嗜冷菌的侵染。3.2.1.1注意消毒。在原料乳采集時(shí)一定要注意對(duì)周?chē)沫h(huán)境、牛的乳房和乳頭、擠奶器具、儲(chǔ)運(yùn)工具等徹底消毒。3.2.1.2縮短加工前牛乳的儲(chǔ)藏時(shí)間。3.2.1.3深度冷藏。溫度較低時(shí)，嗜冷菌的生長(zhǎng)表現(xiàn)較長(zhǎng)的延滯期和世代間隔，原料奶中常見(jiàn)嗜冷菌在4℃時(shí)平均代時(shí)為8～9 h[23]。3.2.1.4添加安全防腐劑。如添加聚磷酸鹽、乳酸鏈球菌素（Nisin）、0.5%的殼寡糖等[8]。3.2.1.5利用無(wú)害技術(shù)。如超聲波、電離輻照保鮮、脈沖電場(chǎng)殺菌、添加乳過(guò)氧化氫酶體系等。3.2.2牛乳加工過(guò)程。3.2.2.1建立健全HACCP和GMP。在生產(chǎn)的過(guò)程中要嚴(yán)格按照HACCP和GMP的要求，嚴(yán)格清洗管道。3.2.2.2滅菌時(shí)調(diào)控時(shí)間和溫度。如巴氏預(yù)處理，嗜冷菌的胞外蛋白酶和脂肪酶具有不能耐受中溫性，在55℃下5-6 min這些酶很容易破壞；還有人利用低溫鈍化方法(LTI)來(lái)提高UHT乳的貨架期，將超高溫滅菌（140℃、5 s）處理后的牛奶冷卻至60℃，保持5 min，可有效地鈍化嗜冷菌產(chǎn)生的蛋白酶和脂肪酶[24]。4.小結(jié)原料乳生產(chǎn)中嗜冷菌污染是常見(jiàn)的問(wèn)題之一，嗜冷菌還影響牛乳的品質(zhì)，使牛乳的發(fā)生腐敗變質(zhì)現(xiàn)象。這一原因的主要是嗜冷菌的耐熱酶導(dǎo)致的。在實(shí)際的生產(chǎn)過(guò)程中一定要樹(shù)立防止細(xì)菌污染的意識(shí)，在生產(chǎn)加工的各個(gè)環(huán)節(jié)注意良好的操作規(guī)范和加強(qiáng)監(jiān)管。要最終解決這個(gè)問(wèn)題，還需要進(jìn)一步研究清楚嗜冷菌及其耐熱酶在牛乳中的作用機(jī)制。參考文獻(xiàn)：[1]Richard Y. 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