李永強^a，楊士花^b，夏曉輝^a，李淳^a，初雅潔^a，黃艾祥^a

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) a.食品科技學(xué)院；b.外語學(xué)院， 昆明 650201) 

 

摘  要：以水牛奶為材料，利用native-PAGE和SDS-PAGE，通過不同溫度和加熱條件下總?cè)榍宓鞍缀蛦误w蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化，研究水牛奶乳清蛋白的熱穩(wěn)定性。結(jié)果表明：水牛奶乳清蛋白在native-PAGE條件下只有b-LG一條條帶，在SDS-PAGE條件下得到4條單體乳清蛋白條帶；隨著提取溫度和時間的增加，水牛奶單體乳清蛋白和總?cè)榍宓鞍踪|(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈下降趨勢，說明水牛奶乳清蛋白熱穩(wěn)定性較差；4種乳清單體蛋白中，a-LA的熱穩(wěn)定性最好，IG的熱穩(wěn)定性最差，熱穩(wěn)定性順序為：a-LA>b-LG>BSA>IG。

關(guān)鍵詞：水牛奶；乳清蛋白；熱穩(wěn)定性；電泳

LI Yong-qiang^a, YANG Shi-hua^b, XIA Xiao-hui^a, LI Chun^a, CHU Ya-jie^a, HUANG Ai-xiang^a

(Yunnan Agricultural University  a.College of Food Science and Technology；

b. College of Foreign Languages, Kunming 650201, China)   

 

Abstract: The heat stability of buffalo milk whey proteins were investigated by means of the changes of total whey proteins and individual whey protein at different heat temperatures and times, using native-PAGE and SDS-PAGE. Results showed only b-LG was found by native-PAGE, but four whey protein bands were found by SDS-PAGE. Individual whey protein and total whey proteins contents were decreased when temperatures and times were increased, indicated buffalo whey proteins had poor heat stability. Among the four individual whey protein, a-LA exhibited the strongest heat-tolerance but IG was opposite. The heat stability order was: a-LA >b-LG >BSA>IG.

Key words：buffalo milk；whey protein；heat stability；electrophoresis

中圖分類號：TS252            文獻標(biāo)識碼：A             文章編號：        

水牛奶被譽為“奶中之王”、“乳中珍品”，營養(yǎng)全面。按總的營養(yǎng)物質(zhì)折算成標(biāo)準(zhǔn)奶，1kg水牛奶相當(dāng)于荷斯坦牛奶1.85kg ^[1]。目前，云南省現(xiàn)有的水牛奶加工產(chǎn)品由于保質(zhì)期較短，很難進入外地市場。超高溫瞬時滅菌（UHT）奶具有保質(zhì)期長，無需冷藏保存等優(yōu)點，但是在加工過程中，水牛奶蛋白質(zhì)由于熱穩(wěn)定性較差，容易發(fā)生膠凝作用，影響了水牛超高溫瞬時滅菌奶的加工，制約了水牛奶產(chǎn)業(yè)的進一步發(fā)展^[2-4]。

水牛奶加熱過程中乳清蛋白的變性被認(rèn)為蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性較差的主要原因。乳清蛋白主要包括β-乳球蛋白（b-lactoglobulin，b-LG）、a-乳白蛋白（a-lactalbumin，a-LA）、牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）和免疫球蛋白（immunoglobulin，IG）^[5-14]。關(guān)于水牛奶乳清蛋白的熱穩(wěn)定性研究鮮有報道，本研究利用非變性native-PAGE電泳和變性SDS-PAGE電泳，研究加熱過程中溫度和時間對水牛奶乳清蛋白穩(wěn)定性的影響，旨在為水牛奶超高溫瞬時滅菌（UHT）加工過程中解決蛋白質(zhì)熱變性提供理論基礎(chǔ)，提高水牛奶產(chǎn)品

的保質(zhì)期和銷售半徑，促進云南省水牛奶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

 

水牛奶，4℃冰箱中冷藏備用；b-LG，a-LA，BSA和IG標(biāo)準(zhǔn)品，TEMED；丙烯酰胺，甲叉丙烯酰胺，Tris–HCl，SDS，β-巰基乙醇，考馬斯亮藍R250；甘油，過硫酸銨，甲醇，冰乙酸，鹽酸，氫氧化鈉等均為分析純。

DYY-6C型電泳儀，DYCZ-24A型電泳槽，WD- 9413A型凝膠成像分析系統(tǒng)。

1.3.1  乳清蛋白制備

水牛奶在4℃于8500g離心15min，得到脫脂水牛奶，取樣品20mL，在50mL具塞試管中于將60，70，80，90℃中分別加熱5，10，15，20，25，30 min；然后在冰浴中迅速冷卻，用6%冰乙酸調(diào)節(jié)水牛奶pH值為4.6，在4℃于10000g離心15min，過濾得到上清，即為乳清蛋白。

1.3.2  非變性native-PAGE電泳^[15]

非變性native-PAGE電泳凝膠包括10%分離膠和4%濃縮膠。乳清蛋白和3倍體積的非變性緩沖溶液（濃度為0.1mol/L的Tris–HCl，pH值為6.8；體積分?jǐn)?shù)為20%的甘油，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%溴酚藍）混合后，用移液器取8μL樣品點樣進行電泳，用質(zhì)量濃度為1g/L的R250考馬斯亮藍染色，體積分?jǐn)?shù)為7.5%的甲醇 和體積分?jǐn)?shù)為 7.5% 冰乙酸脫色。標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)標(biāo)樣b-LG，a-LA，BSA和IG同時電泳。

1.3.3  變性SDS-PAGE電泳^[15]

變性SDS-PAGE電泳凝膠包括質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.5%分離膠和4%濃縮膠。蛋白質(zhì)樣品和3倍體積的變性緩沖溶液（濃度為0.1mol/L的Tris–HCl，pH值為6.8；體積分?jǐn)?shù)為20%的甘油，體積分?jǐn)?shù)為2%的SDS，體積分?jǐn)?shù)為5%的β-巰基乙醇， 0.01%溴酚藍）混合后，沸水浴中加熱5min，4℃于10000g離心15min，吸取上清8~10μL進行SDS-PAGE電泳。標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)標(biāo)樣b-LG、a-LA、BSA和IG同時電泳。

1.3.4  染色

染色液：0.1g考馬斯亮藍（R-250），50 mL乙醇, 10 mL冰乙酸，加水定容至100mL。

取出凝膠，去掉濃縮膠，作好標(biāo)記，倒入染色液搖床染色過夜。

1.3.5  脫色

脫色液：100 mL甲醇, 100 mL冰乙酸,和800 mL水。

用脫色液脫色1~2d。

1.3.6  凝膠成像

利用凝膠成像系統(tǒng)進行蛋白的定性定量。

    乳清蛋白非變性native-PAGE電泳結(jié)果如圖1所示。圖2為溫度和時間對β-乳球蛋白質(zhì)量濃度的影響。

     圖1中，1為對照；2為60℃，5min；3為60℃，10min；4為60℃，15min；5為60℃，20min；6為60℃，25min；7為60℃，30min；8為70℃，5min；9為70℃，10min；10為70℃，15min；11為70℃，15min；12為70℃，20min；13為70℃，25min；14為70℃，30min；15為80℃，5min；16為80℃，10min；17為80℃，15min；18為80℃，20min；19為80℃，25min；20為80℃，30min；21為90℃，5min；22為90℃，10min。下同。

 由圖1可以看出，在native-PAGE電泳中，只得到了b-乳球蛋白一條帶，可能由于在非變性條件下，水牛奶中其他三種乳清蛋白穩(wěn)定性較差，b-乳球蛋白穩(wěn)定性相對較好，電泳時樣品中只有b-乳球蛋白。故只對b-乳球蛋白進行分析。

    由圖1和圖2可以看出，在60℃下，隨著加熱時間的延長β-乳球蛋白的質(zhì)量濃度從112.16 g•L^-1降到89.55 g•L^-1，變化并不明顯，說明β-乳球蛋白在溫度較低時比較穩(wěn)定；隨著溫度的增加和加熱時間的延長，b-乳球蛋白質(zhì)量濃度呈明顯的下降趨勢；在90℃下加熱10min后，b-乳球蛋白條帶完全消失，說明高溫下b-乳球蛋白不穩(wěn)定，且隨加熱時間的延長，穩(wěn)定性下降。

    乳清蛋白SDS-PAGE電泳如圖3所示。圖4為溫度和時間對乳清蛋白總量的影響。

   

 

     圖3中，1~22同上。23為90℃，15min；24為90℃，20min；25為90℃，25min；26為90℃，30min；27為90℃，30min。

    由圖5可以看出，隨著提取溫度和時間的增加，水牛奶單體乳清蛋白質(zhì)量濃度呈現(xiàn)下降趨勢，且均小于空白對照的質(zhì)量濃度3.20，2.86，126.23，15.74 g•L^-1，說明溫度對水牛奶各單體乳清蛋白都有影響。

對于IG，溫度為80℃和90℃下均沒有條帶，70℃下加熱20min后也沒有條帶，說明蛋白已經(jīng)完全分解，說明IG對溫度和加熱時間十分敏感；對于BSA，90℃下均沒有條帶，80℃下加熱5min后也沒有條帶，說明BSA對溫度和加熱時間也比較敏感；對于b-LG，90℃下加熱10min后條帶消失；a-LA在各種溫度下均有條帶。說明4種乳清單體蛋白中，a-LA的熱穩(wěn)定性最好，IG的熱穩(wěn)定性最差，熱穩(wěn)定性順序為：a-LA >b-LG >BSA>IG。

  （1）水牛奶乳清蛋白在native-PAGE條件下只有b-LG一條條帶，在SDS-PAGE條件下得到4條單體乳清蛋白條帶，說明SDS-PAGE較適合研究水牛奶乳清蛋白。

  （2）隨著提取溫度和時間的增加，水牛奶單體乳清蛋白和總?cè)榍宓鞍踪|(zhì)量濃度均呈下降趨勢，說明水牛奶乳清蛋白熱穩(wěn)定性較差。

  （3）4種乳清單體蛋白中，a-LA的熱穩(wěn)定性最好，IG的熱穩(wěn)定性最差，熱穩(wěn)定性順序為：a-LA >b-LG >BSA>IG。

 

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基金項目：云南省教育廳科學(xué)研究基金項目(2010Y342)，云南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)奶牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目—乳品加工與質(zhì)量安全研究

作者簡介：李永強(1975—)，男，講師，博士，研究方向為天然產(chǎn)物化學(xué)。E-mail：liyongqiang7512@163.com    13987611915

*通訊作者：黃艾祥，博士，教授。