PCR定性篩選檢測(cè)方法

　　1996年德國(guó)伯恩斯坦大學(xué)的MeyerRolf等論證了PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因食品的可能性，植物細(xì)胞轉(zhuǎn)入的基因成分一般包括啟動(dòng)子(promotor)、報(bào)告基因(reportergene)、目的基因(targetgene)和終止子(terminator)，其中啟動(dòng)子和終止子為表達(dá)目的基因所必需。目前，轉(zhuǎn)基因植物所采用的啟動(dòng)子主要為來(lái)源于花椰菜花葉病毒的Camv35s啟動(dòng)子、根瘤農(nóng)桿菌的nos啟動(dòng)子及玄參花葉病毒的FMV35s啟動(dòng)子；廣泛應(yīng)用的終止子分別來(lái)源于根瘤農(nóng)桿菌的nos終止子、花椰菜花葉病毒的camv終止子以及新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶NptII終止子。針對(duì)這些基因的PCR擴(kuò)增可涵蓋95％的現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因植物的需要。

　　PCR定性檢測(cè)是高靈敏度的DNA水平檢測(cè)，但常伴有各種假性結(jié)果出現(xiàn)：(1)DNA提取時(shí)產(chǎn)生的各種反應(yīng)抑制因子，使PCR呈假陰性；(2)產(chǎn)品深加工時(shí)核酸被破壞成碎片，含量極低，使PCR呈假陰性；(3)當(dāng)作物受到花椰菜花葉病毒的感染而帶有35S啟動(dòng)子或因農(nóng)桿菌感染而帶有nos終止子時(shí)，PCR呈假陽(yáng)性；(4)實(shí)驗(yàn)室的殘留污染使檢測(cè)結(jié)果呈假陽(yáng)性；(5)在收獲、運(yùn)輸或加工過(guò)程中轉(zhuǎn)基因食品與非轉(zhuǎn)基因食品產(chǎn)生交叉污染也會(huì)使檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。

　　要防止檢測(cè)出現(xiàn)假陰性結(jié)果，必須在檢測(cè)過(guò)程中嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，優(yōu)化PCR條件，在DNA提取過(guò)程中盡量去除可能抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)，并可通過(guò)擴(kuò)增真核生物的18SrRNA基因來(lái)消除假陰性；要消除轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)中假陽(yáng)性結(jié)果的影響，可采用southern雜交、PCR產(chǎn)物純化測(cè)序或PCR擴(kuò)增產(chǎn)物酶切分析等方法，對(duì)樣品同時(shí)檢測(cè)其Camv35s和nos基因雙元件，可避免某些作物因自然感染花椰菜花葉病毒或根癌農(nóng)桿菌產(chǎn)生的假陽(yáng)性結(jié)果。

　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR法

　　實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)于1996年由美國(guó)AppliedBiosystems公司推出，是指在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上添加了一條標(biāo)記了兩個(gè)熒光基團(tuán)的探針，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量的方法。目前我們應(yīng)用于實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)體系中的熒光探針主要有3種：分子信標(biāo)探針，TaqMan探針和雜交雙探針。

　　實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的靈敏度至少是競(jìng)爭(zhēng)PCR的10倍，它可以檢測(cè)到每克樣品中含2pg轉(zhuǎn)基因的DNA量。對(duì)加工、未加工和混合樣品都可以進(jìn)行檢測(cè)。

　　實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，可對(duì)整個(gè)PCR進(jìn)程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。此外，實(shí)時(shí)熒光PCR采用閉管分析，無(wú)需電泳等PCR后處理步驟，能有效消除核酸的交叉污染。由于在PCR反應(yīng)體系中加入熒光探針，使得非特異性產(chǎn)物不能與探針雜交，尤其對(duì)與特異性產(chǎn)物分子量接近、通過(guò)電泳無(wú)法分開(kāi)的產(chǎn)物更為有效。當(dāng)前此方法的挑戰(zhàn)就是定量標(biāo)準(zhǔn)物的滯后發(fā)展，商業(yè)化的標(biāo)準(zhǔn)物已不能滿足日漸增長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)需要。Moreano等以轉(zhuǎn)基因油菜籽為檢測(cè)目標(biāo)發(fā)展出了一種新型標(biāo)準(zhǔn)物的合成方法，從而為提高熒光定量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化程度指明了方向。

　　基因芯片檢測(cè)法

　　當(dāng)今應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)的前沿技術(shù)當(dāng)屬基因芯片技術(shù)，其實(shí)質(zhì)就是高度集成化的反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)。探針?lè)肿庸潭ㄔ谳d體上，待測(cè)基因經(jīng)過(guò)PCR、末端標(biāo)記等操作，成為標(biāo)記有熒光染料或同位素的核酸分子，然后與固定的探針雜交。依據(jù)標(biāo)記方法的不同，通過(guò)放射自顯影、激光共聚焦顯微鏡或CCD相機(jī)讀出每個(gè)斑點(diǎn)信號(hào)的強(qiáng)度，計(jì)算機(jī)對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行處理，得到雜交譜。該技術(shù)是20世紀(jì)90年代由美國(guó)的Affymetrix公司首先發(fā)展起來(lái)的，該公司曾在1996年制造出世界上第一塊商品化基因芯片。

　　免疫學(xué)和PCR檢測(cè)技術(shù)大部分情況下一次實(shí)驗(yàn)只能檢測(cè)1種目標(biāo)分子，在少數(shù)情況下能同時(shí)檢測(cè)2～3種目標(biāo)分子。基因芯片能解決大數(shù)量基因檢測(cè)問(wèn)題，具有靈敏度高、效率高、成本低、自動(dòng)化、結(jié)果明確等優(yōu)點(diǎn)。但由于其應(yīng)用需要的相應(yīng)設(shè)備造價(jià)高，普及范圍窄，而且目前沒(méi)有形成任何標(biāo)準(zhǔn)，使得基因芯片檢測(cè)法應(yīng)用范圍不廣。

　　多重連接依賴的探針擴(kuò)增(MLPA)

　　此方法是轉(zhuǎn)基因多重定量檢測(cè)的最新進(jìn)展，最初是由荷蘭的Dr．SchoutenJP于2002年發(fā)表的應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢測(cè)目的高度靈敏的相對(duì)定量技術(shù)。它是利用簡(jiǎn)單的雜交、連接、PCR擴(kuò)增反應(yīng)，于單一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢測(cè)最多40個(gè)不同的核苷酸序列的拷貝數(shù)變化。

　　MLPA方法是針對(duì)不同檢測(cè)序列設(shè)計(jì)多組專一的探針組，對(duì)探針組進(jìn)行擴(kuò)增的檢測(cè)方法。每組探針組總長(zhǎng)度不同，可與目標(biāo)序列雜交黏合。所有探針的5′端都有通用引物結(jié)合區(qū)PBS(primerbindingsites)，3′端都有與待擴(kuò)增目標(biāo)序列結(jié)合區(qū)，在PBS區(qū)與目標(biāo)序列結(jié)合區(qū)之間插入不同長(zhǎng)度的寡核苷酸，由此形成長(zhǎng)度不一的探針組。如果目標(biāo)序列缺失、產(chǎn)生突變或是由于不同探針組的配對(duì)，則這組探針無(wú)法成功連接，也沒(méi)有相應(yīng)的擴(kuò)增反應(yīng)。如果這組探針可與目標(biāo)序列完全黏合，則連接酶會(huì)將這組探針連接成為一個(gè)片段，并通過(guò)標(biāo)記的通用引物對(duì)此連接在一起的探針組進(jìn)行擴(kuò)增。最終經(jīng)過(guò)毛細(xì)管電泳和激光誘導(dǎo)的熒光來(lái)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

　　FranciscoMoreano等應(yīng)用此方法檢測(cè)了標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因大豆和玉米并經(jīng)過(guò)特異性和敏感性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了MLPA在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中的可行性。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)探針與目標(biāo)序列結(jié)合的片段長(zhǎng)度越長(zhǎng)，檢測(cè)的敏感性就增加，并且根據(jù)轉(zhuǎn)基因序列擴(kuò)增強(qiáng)度與內(nèi)參基因擴(kuò)增強(qiáng)度的比值和轉(zhuǎn)基因含量之間的線性關(guān)系，可以對(duì)待檢樣品進(jìn)行定量分析。