抗菌肽BCp12保鮮膜的制備及其對(duì)乳扇保鮮的影響

楊婷婷，楊 婧，袁子又，趙 瓊，楊 昆，黃艾祥^*

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南  昆明  650201)

摘  要：為延長(zhǎng)乳扇的貨架期，以酪蛋白、殼聚糖為原料包裹抗菌肽BCp12來(lái)制備復(fù)合保鮮膜。以膜的斷裂伸長(zhǎng)率、拉伸強(qiáng)度、抑菌活性為指標(biāo)篩選出最佳的制備工藝，利用SEM、FT-IR及分子對(duì)接探究復(fù)合膜的形成機(jī)理，并將其應(yīng)用于乳扇保鮮。結(jié)果表明，可食膜的最佳制備工藝為酪蛋白/殼聚糖比例1：1.5、BCp12 1mg/mL、甘油含量1.5%、干燥溫度55 ℃。SEM顯示復(fù)合膜具有良好的相容性及FT-IR顯示該膜中1545.67 cm^-1為C-O伸縮振動(dòng)吸收峰且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。分子對(duì)接表明BCp12與酪蛋白、殼聚糖之間主要通過(guò)殘基Y4與-NH₂活性位點(diǎn)產(chǎn)生氫鍵相互作用。與對(duì)照組相比，該膜能顯著延長(zhǎng)乳扇的保質(zhì)期，以期為BCp12/殼聚糖/酪蛋白復(fù)合膜的應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供一定的技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞：保鮮膜；抗菌肽BCp12；分子對(duì)接；乳扇保鮮

Preparation of Antimicrobial Peptide BCp12 Edible Film and its Effect on the Preservation of Milk Fan

YANG Tingting, YANG Jing, YUAN Ziyou, ZHAO Qiong, YANG Kun, HUANG Aixiang*

(College of Food Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China)

Abstract: In order to prolong the shelf life of milk fan, casein and chitosan were used as raw materials to wrap antimicrobial peptide BCp12 to prepare edible film. The optimum preparation process was selected based on the elongation at break, tensile strength and antimicrobial activity of the film. The formation mechanism of the edible film was explored by SEM, FT-IR and molecular docking, and it was applied to the preservation of milk fan. The results showed that the optimum preparation conditions were casein/chitosan ratio 1:1.5, 1 mg/mL of BCp12, 1.5 % of glycerin content (v/v), drying temperature was 55 ℃. The edible film had good compatibility and was C-O stretching vibration absorption peak in 1545.67 cm^-1. Molecular docking showed that the hydrogen bond interaction between BCp12 and casein and chitosan mainly occurred through the active site of residues Y4 and -NH₂. Compared with the control group, this film can significantly prolong the shelf life of milk fan, in order to provide a certain technical reference for the application and development of BCp12/chitosan/casein edible film.

Keywords: edible film; antimicrobial peptide BCp12; molecular docking; preservation

隨著人們生活質(zhì)量的提高，微生物污染引起的食源性疾病極大的危害了人體健康，防止食品微生物污染已經(jīng)迫在眉睫。乳品作為人們生活必需品，其中常見(jiàn)的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌是國(guó)家食品衛(wèi)生法中強(qiáng)制檢測(cè)的致病菌^[1]。由于可食性包裝^[2-3]具有對(duì)人體無(wú)害、抗菌、綠色環(huán)保及延長(zhǎng)食品貨架期等優(yōu)點(diǎn)，常用來(lái)抑制食品中微生物生長(zhǎng)。目前，應(yīng)用最多的天然高分子材料通常是蛋白質(zhì)類(lèi)、多糖類(lèi)及復(fù)合類(lèi)^[4]。

與普通保鮮膜相比，天然保鮮膜具有保鮮、可食、安全等優(yōu)點(diǎn)，賦予成膜壁材在食品包裝中具有很高的應(yīng)用價(jià)值。殼聚糖是地球上的第二大生物資源多糖，僅次于纖維素，是天然可再生資源^[5-6]，它具有抗菌性、生物相容性和無(wú)毒性等優(yōu)點(diǎn)，因此可開(kāi)發(fā)成食品包裝材料^[7-8]，是研究和應(yīng)用最廣泛的可食膜之一。殼聚糖常與其他物質(zhì)復(fù)配用于食品保鮮，如番茄^[9]、銀鯉^[10]等，均表現(xiàn)出較好的保鮮效果。酪蛋白具有耐熱性、乳化性、溶解性等功能特性，因此它能形成薄膜以阻止食品與外界接觸并免受污染^[11-12]。但由于酪蛋白自身的親水性及不具備抗菌性的缺點(diǎn)，膜的性能有待提高。有研究表明，殼聚糖、酪蛋白復(fù)配使用可提高蛋白的溶解性及成膜性^[13]。然而，抗菌肽是高等真核生物中先天免疫系統(tǒng)的重要部分，一般含有100個(gè)以下或有廣譜抑菌活性的小分子多肽，其有抗病毒、抗菌甚至抗癌細(xì)胞等多種活性功能^[14-15]。在前期研究中，Zhao^[16]等從檳榔江水牛奶酪蛋白中分離了新型抗菌肽BCp12，該肽序列為YLGYLEQLLRLK，分子量為1508.82 Da，具有低毒性。隨后，李鈺芳、楊昆等人研究了抗菌肽BCp12對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌機(jī)理^[17-18]，若能將其用于復(fù)合膜的制備，將提高抗菌肽在食品保鮮方面的應(yīng)用。目前將抗菌肽BCp12、殼聚糖與酪蛋白復(fù)配使用，研究其制備工藝及保鮮效果的報(bào)道較少。

本文以酪蛋白、殼聚糖和抗菌肽BCp12為原料制備復(fù)合膜，研究其機(jī)械性能和抑菌效果，同時(shí)通過(guò)微觀結(jié)構(gòu)、分子對(duì)接考察了復(fù)合膜的相容性及活性位點(diǎn)，并將其應(yīng)用于乳扇保鮮，為BCp12/殼聚糖/酪蛋白復(fù)合膜在食品保鮮方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1  材料、試劑及實(shí)驗(yàn)室病原菌

抗菌肽BCp12是貫筋藤蛋白酶酶解檳榔江水牛酪蛋白，發(fā)現(xiàn)該序列來(lái)源于牛αS1-酪蛋白，屬于新型抗菌肽，由安徽國(guó)平藥業(yè)有限公司合成，純度為95%以上。

金黃色葡萄球菌CICC 10384、大腸桿菌CICC 10003  中國(guó)工業(yè)菌種保藏中心；乳扇  云南省大理州；酪蛋白酸鈉  Solarbio生物科技有限公司；殼聚糖(食品級(jí))  河南雙騰實(shí)業(yè)有限公司。

1.2  儀器與設(shè)備

CR-400/410色彩色差儀  深圳大略電子儀器有限公司；HD-3A水分活度測(cè)定儀  廈門(mén)市弗布斯檢測(cè)設(shè)備有限公司；Nicolet iS10近紅外光譜儀  賽默飛世爾科技公司；FlexSEM1000掃描電子顯微鏡  日本日立高新公司；Haloes Calipe抑菌圈測(cè)量?jī)x  西班牙IUL。

1.3  方法

1.3.1  酪蛋白/殼聚糖/BCp12復(fù)合膜的制備

1.3.1.1  復(fù)合膜的制備工藝

參考文獻(xiàn)^[19]的方法，稱(chēng)取3.0 g殼聚糖溶于1%冰乙酸中，并加入1.5%甘油，于磁力攪拌器攪拌30 min后制成殼聚糖溶液。接著，配制1%酪蛋白酸鈉溶液攪拌30 min使其溶解，將二者混勻并攪拌6 h備用。隨后，將1%的BCp12溶液加入到酪蛋白/殼聚糖膜液中于40 ℃水浴加熱攪拌6 h，并超聲脫氣30 min，即得到BCp12/殼聚糖/酪蛋白復(fù)合膜液，待溶液均勻后流延成膜，放入烘箱烘干備用。

1.3.1.2  單因素

以酪蛋白/殼聚糖比例、甘油含量、干燥溫度為單因素，考察每個(gè)單因素對(duì)復(fù)合膜機(jī)械性能的影響，可得最佳工藝參數(shù)。以酪蛋白和殼聚糖濃度各20 mg/mL，研究不同的酪蛋白/殼聚糖比例(2：1、1.5：1、1：1、1：1.5和1：2)、甘油含量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%)、干燥溫度(45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃和65 ℃)對(duì)復(fù)合膜性能的影響。測(cè)定每個(gè)單因素時(shí)，其他因素固定為酪蛋白/殼聚糖比例1：1.5，甘油含量為1.5%，干燥溫度為55 ℃。

1.3.1.3  復(fù)合膜機(jī)械性能測(cè)試

參照文獻(xiàn)^[20]，參考GB/T 1040.3-2006《塑料  拉伸性能的測(cè)定》中的方法，利用質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行測(cè)定。采用厚度測(cè)量?jī)x在復(fù)合膜上取9個(gè)點(diǎn)進(jìn)行厚度測(cè)定，取平均值。

抗拉強(qiáng)度的計(jì)算：

式中：T_s為復(fù)合膜的抗拉強(qiáng)度（MPa）；F為復(fù)合膜斷裂時(shí)的最大張力（N）；b為復(fù)合膜寬度（mm）；d為復(fù)合膜厚度（mm）。

斷裂伸長(zhǎng)率的計(jì)算：

式中：E為復(fù)合膜斷裂伸長(zhǎng)率（%）；L為復(fù)合膜斷裂時(shí)的伸長(zhǎng)長(zhǎng)度（mm）；L為復(fù)合膜的初始長(zhǎng)度（mm）。

1.3.2  復(fù)合膜的掃描電鏡(SEM)微觀形態(tài)

將復(fù)合膜液的凍干粉在金屬樣品臺(tái)上干燥，真空條件下噴金30 min后，將處理好的待測(cè)樣品于掃描電子顯微鏡中進(jìn)行檢測(cè)，調(diào)整工作電壓為2.0 kV。

1.3.3  復(fù)合膜的紅外光譜(FT-IR)

采用傅里葉變換紅外光譜儀測(cè)定樣品，分辨率4 cm^-1，掃描范圍400-4000 cm^-1。

1.3.4  分子對(duì)接

使用AutoDock vina 1.1.2軟件通過(guò)分子對(duì)接法分析殼聚糖和酪蛋白的結(jié)合方式^[21]。酪蛋白和殼聚糖的晶體結(jié)構(gòu)是從結(jié)構(gòu)生物學(xué)(RCSB)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(pdb；https://www.rcsb.org/)中下載的，殼聚糖和酪蛋白的結(jié)構(gòu)用Chemical Bio Drawn Ultra 14.0 軟件繪制。從RCSB PDB中得到CSN1S1、CSN1S2、CSN2和CSN3酪蛋白等4種蛋白的x射線晶體結(jié)構(gòu)，保存為pdbqt格式。然后，使用蛋白來(lái)計(jì)算晶體結(jié)構(gòu)和最低的能量，其將設(shè)置成對(duì)接的相互作用位點(diǎn)，利用AutoDockTools 1.5.6包生成對(duì)接輸入文件。挑選出最低結(jié)合能的復(fù)合物為最有利的結(jié)合方式，并采用Pymol 2.3.0將對(duì)接結(jié)果可視化。

1.3.5  BCp12復(fù)合膜液的抑菌實(shí)驗(yàn)

參考魏奇^[22]等的方法，將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，無(wú)菌去離子水稀釋10倍梯度備用。用已滅菌的不銹鋼打孔器在平板上打孔，將BCp12不同含量(0.2 mg/mL-1.0 mg/mL)的殼聚糖/酪蛋白膜液向每個(gè)孔中加入25 μL。以不含BCp12的膜液作為空白組，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3個(gè)平行。觀察并統(tǒng)計(jì)抑菌圈大小和抑菌圈的直徑，評(píng)價(jià)抗菌性能的效果。

1.3.6  復(fù)合膜對(duì)乳扇的保鮮作用

1.3.6.1  乳扇的處理

將乳扇樣品在無(wú)菌操作室里剪成每片質(zhì)量為1 g且大小為6 cm x 1.5 cm的長(zhǎng)方形，覆蓋膜后分成對(duì)照組、1組(殼聚糖/酪蛋白復(fù)合膜)、2組(殼聚糖/酪蛋白復(fù)合膜+Nisin)、3組(殼聚糖/酪蛋白復(fù)合膜+1 mg/mL BCp12)等四個(gè)組，且對(duì)照組不做任何處理。將普通薄膜剪成5 cm×5 cm的大小，將處理過(guò)的乳扇先用復(fù)合膜包裹，再用普通膜覆蓋避免污染，置于4 ℃冰箱貯藏。

1.3.6.2  感官評(píng)定

將4個(gè)處理組的乳扇在明亮寬敞、通風(fēng)良好、無(wú)特殊氣味的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，挑選10位評(píng)價(jià)人員組成評(píng)定小組對(duì)乳扇成品的色澤、滋味和氣味、組織狀態(tài)進(jìn)行評(píng)分，最終得分為取各項(xiàng)目的平均分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)詳見(jiàn)表：

表1  感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

Table.1  Sensory assessment criteria

1.3.6.3  過(guò)氧化值的測(cè)定

參考GB 5009.227-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)  食品中過(guò)氧化值的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6.4  水分活度(Aw)的測(cè)定。

參考GB 5009.238-2016食品中水分活度的測(cè)定(第二法)，分別稱(chēng)取1.00 g樣品置于水分活度儀中，10 min后記錄測(cè)量值。

1.3.6.5  色差值的測(cè)定

采用色彩色差儀測(cè)定各處理組乳扇的顏色，使樣品與測(cè)試端口無(wú)縫隙，隨機(jī)采點(diǎn)進(jìn)行3次測(cè)定，記錄樣品的L^*（亮度）值、b^*（黃度）值，取平均值。

1.3.6.6  菌落總數(shù)的測(cè)定

參考GB 4789.2-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)  食品微生物學(xué)檢驗(yàn)  菌落總數(shù)測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定。

1.4  數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)重復(fù)三次，測(cè)定結(jié)果取平均值。采用SPSS Statistics 26軟件、Origin 8.0軟件和Design-Expert 10軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。因素間的顯著性通過(guò)方差進(jìn)行分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1  BCp12/殼聚糖/酪蛋白復(fù)合膜的制備

2.1.1  單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1.1  酪蛋白/殼聚糖比例對(duì)復(fù)合膜性能的影響

由圖1可知，隨著殼聚糖含量的增加，復(fù)合膜的拉伸強(qiáng)度先增大后減小，當(dāng)酪蛋白與殼聚糖的比例為1：1時(shí)，拉伸強(qiáng)度達(dá)到最大值。殼聚糖上的游離氨基和羥基與酪蛋白分子之間存在氫鍵作用，當(dāng)用磁力攪拌器充分混合時(shí)，二者可在分子水平上產(chǎn)生物理交聯(lián)，所以復(fù)合膜的強(qiáng)度較好^[23-24]。酪蛋白與殼聚糖在1：1.5時(shí)斷裂伸長(zhǎng)率最大，但隨殼聚糖的增加而降低。這可能是由于殼聚糖濃度過(guò)大，二者相容性變差，導(dǎo)致復(fù)合膜的拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率均下降。因此，選擇酪蛋白：殼聚糖1：1.5為最適比例。

圖1  酪蛋白/殼聚糖比例對(duì)復(fù)合膜拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率的影響

Fig.1  Effect of Casein/chitosan ratio on tensile strength and elongation at break of composite membrane

2.1.1.2  甘油含量含量對(duì)復(fù)合膜性能的影響

甘油可以作為增加復(fù)合膜的相容性和可塑性的增塑劑，對(duì)提高其力學(xué)性能有重要影響^[25]。如圖2所示，隨著甘油含量增大，拉伸強(qiáng)度呈下降趨勢(shì)，而斷裂伸長(zhǎng)率呈上升趨勢(shì)。可能是甘油與酪蛋白和殼聚糖分子之間產(chǎn)生氫鍵作用并軟化了高聚物的剛性結(jié)構(gòu)，使得高聚物鏈段的流動(dòng)性增加。但甘油過(guò)多會(huì)使酪蛋白和殼聚糖的相互作用力減弱，且膜的拉伸強(qiáng)度不佳及力學(xué)性能下降。當(dāng)甘油含量為1.5%時(shí)復(fù)合膜具有較好的拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率。這與張一妹等^[26-27]研究結(jié)果一致：甘油含量越低，綜合性能越好，故選擇甘油含量為1.5%。

圖2  甘油含量對(duì)復(fù)合膜拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率的影響

Fig.2  Effect of Glycerol content on tensile strength and elongation at break of composite membrane

2.1.1.3  干燥溫度對(duì)復(fù)合膜性能的影響

從圖3可以看出：拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率隨著干燥溫度的升高呈先升高后降低的趨勢(shì)，拉伸強(qiáng)度受溫度影響較明顯，斷裂伸長(zhǎng)率在55 ℃之前變化緩慢，55 ℃之后迅速下降。當(dāng)干燥溫度上升時(shí)，溶劑蒸發(fā)留下的空穴過(guò)多，造成復(fù)合膜的結(jié)構(gòu)缺陷和裂縫，故其拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率差，而低溫條件下形成的復(fù)合膜結(jié)構(gòu)更致密及性能較好。該結(jié)果與方健^[28]的結(jié)果相似，故選擇55 ℃為最佳干燥溫度。

圖3  干燥溫度對(duì)復(fù)合膜拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率的影響

Fig.3  Effect of drying temperature on tensile strength and elongation at break of composite film

2.2  SEM表征分析

復(fù)合膜粉的SEM譜圖見(jiàn)圖4。復(fù)合膜的抗拉強(qiáng)度、斷裂伸長(zhǎng)率和水蒸氣透過(guò)系數(shù)是由組成膜的大分子決定的。這些大分子成膜時(shí)是否均勻或完全溶解將直接影響可食膜的性質(zhì)。由圖4A可知，殼聚糖膜表面光滑致密平整，表明膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)均勻。加入抗菌肽BCp12后，殼聚糖膜表面開(kāi)始出現(xiàn)孔隙(圖4B)，這可能是由于BCp12進(jìn)入殼聚糖內(nèi)部，冷凍干燥成膜粉后留下的小孔。圖4C可見(jiàn)蛋白質(zhì)顆粒且表面較粗糙，膜中出現(xiàn)孔隙和區(qū)塊的現(xiàn)象^[29]，說(shuō)明BCp12可能負(fù)載在復(fù)合膜上。這與前面的抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率結(jié)果結(jié)合，可能是由于抗菌肽會(huì)使膜內(nèi)部出現(xiàn)孔隙的原因^[30]，將導(dǎo)致復(fù)合膜的抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率下降。與劉敏^[31]結(jié)果類(lèi)似，說(shuō)明BCp12可與酪蛋白、殼聚糖混合使用。

圖4  殼聚糖膜(A)、殼聚糖/BCp12復(fù)合膜(B)和酪蛋白/殼聚糖/BCp12復(fù)合膜液凍干粉(C)的SEM圖

Fig.4  SEM images of chitosan membrane(A), chitosan/BCp12 composite membrane(B) and casein/chitosan/BCp12 composite membrane liquid freeze-dried powder(C)

2.3  FT-IR表征分析

從圖5可知，BCp12中1656.86 cm^-1處是酰胺I帶對(duì)應(yīng)的C=O伸縮振動(dòng)，1440.60 cm^-1處是酰胺Ⅱ帶，1314.96 cm^-1處是酰胺Ⅲ帶，1182.63 cm^-1對(duì)應(yīng)的是C-O伸縮振動(dòng)。而BCp12/殼聚糖在1630.05 cm^-1處的吸收峰對(duì)應(yīng)于酰胺I帶C=O的伸縮振動(dòng)，1455.10 cm^-1處的是酰胺Ⅱ帶，1320.93 cm^-1處的是酰胺Ⅲ帶，1157.75 cm^-1對(duì)應(yīng)的是C-O伸縮振動(dòng)^[32]。根據(jù)沈亞麗^[33]的研究，殼聚糖在3436 cm^-1處的峰寬歸屬于O-H和N-H的伸縮振動(dòng)重疊峰，1642 cm^-1處的吸收峰歸屬于C=O的伸縮振動(dòng)（酰胺I帶）。而BCp12/殼聚糖的FT-IR圖中少了1602 cm^-1處的吸收峰，使其峰面積變寬并向低波數(shù)移動(dòng)，說(shuō)明BCp12/殼聚糖之間存在氫鍵作用。

BCp12/酪蛋白在1642.15 cm^-1處的吸收峰對(duì)應(yīng)的是酰胺I帶C=O的伸縮振動(dòng)，1446.56 cm^-1對(duì)應(yīng)的是酰胺Ⅱ帶，1314.63 cm^-1處的是酰胺Ⅲ帶，1172.06 cm^-1處的是C-O伸縮振動(dòng)。根據(jù)沈亞麗^[33]的研究，殼聚糖在N-H彎曲振動(dòng)吸收峰為1602 cm^-1，BCp12/酪蛋白/殼聚糖復(fù)合膜的吸收峰為1545.67 cm^-1，由于膜內(nèi)的氨基發(fā)生質(zhì)子化，形成了NH₃⁺，說(shuō)明添加BCp12具有更低的波數(shù)。BCp12/酪蛋白/殼聚糖復(fù)合膜中C-O伸縮振動(dòng)波數(shù)顯著性下降并增強(qiáng)，這是由于基團(tuán)間形成了氫鍵，使伸縮振動(dòng)向低波數(shù)移動(dòng)。Huang等^[34]利用FT-IR研究了大豆分離蛋白和殼聚糖復(fù)合使用時(shí)有類(lèi)似的結(jié)論。

與BCp12/酪蛋白膜相比，BCp12/酪蛋白/殼聚糖復(fù)合膜的特征峰幾乎均向低波數(shù)偏移，但未超過(guò)BCp12/殼聚糖的特征峰波數(shù)。研究表明，若兩種水性高分子相容性較好，分子間氫鍵相互作用會(huì)加強(qiáng)，表現(xiàn)為羧基振動(dòng)峰向低波數(shù)方向偏移^[35]，形成分子內(nèi)氫鍵會(huì)使吸收強(qiáng)度增加并變寬。因此，可得到BCp12/酪蛋白/殼聚糖復(fù)合膜內(nèi)部存在較強(qiáng)的氫鍵作用，使之具有良好的相容性，這與張立挺^[36]的結(jié)果類(lèi)似。

圖5  a、b、c和d分別代表BCp12、BCp12/殼聚糖、BCp12/酪蛋白和BCp12/殼聚糖/酪蛋白復(fù)合物的FT-IR圖

Fig.5  a, b, c and d represent FT-IR Spectra of BCp12, BCp12/chitosan, BCp12/casein and BCp12/chitosan/casein complexes, respectively

2.4  分子對(duì)接

分子對(duì)接在結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)研究中有著廣泛的應(yīng)用，通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬等方法可以預(yù)測(cè)主要蛋白與活性物質(zhì)間的結(jié)合位點(diǎn)及作用方式^[37]。由圖6可知，CSN1S1、CSN1S2、CSN2和CSN3酪蛋白均能較好的對(duì)接于BCp12的活性中心位點(diǎn)，其中，CSN1S1酪蛋白的殘基Q112、Y109、K118與BCp12的殘基Y1、Y4、Q7、K12之間通過(guò)-NH₂、-C=O、-OH形成5個(gè)氫鍵，最低結(jié)合能-6.3 kcal/mol。與CSN1S1酪蛋白相比，CSN1S2酪蛋白的殘基E66、A62與BCp12的殘基L2、G3、Y4之間存在3個(gè)氫鍵且長(zhǎng)度為3.0 Å。并且CSN2酪蛋白的殘基Q138、K128與BCp12殘基的L8、L9之間存在2個(gè)氫鍵且結(jié)合能為-7.3 kcal/mol。而CSN3酪蛋白殘基的G20、P115與BCp12殘基的Y1、Y4之間存在2個(gè)氫鍵且結(jié)合能為-5.4 kcal/mol。相關(guān)研究表明酪蛋白和藏紅花素的殘基ASN92、PRO57、THR99、ILE45、LYS47之間存在較強(qiáng)的氫鍵作用，說(shuō)明酪蛋白和藏紅花素結(jié)合后結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定^[38]。因此，可以推測(cè)BCp12的殘基Y4和酪蛋白之間通過(guò)-NH₂形成氫鍵作用引起復(fù)合膜的聚集，使其具有低結(jié)合能和穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)^[39]。

圖6  CSN1S1酪蛋白-殼聚糖(a)、CSN1S2酪蛋白-殼聚糖(b)、CSN2酪蛋白-殼聚糖(c)和CSN3-酪蛋白-殼聚糖(d)的分子對(duì)接圖

Fig.6  Molecular docking diagrams of CSN1S1 casein-chitosan(a), CSN1S2 casein-chitosan(b), CSN2-casein-chitosan(c) and CSN3-casein-chitosan(d)

2.4  BCp12復(fù)合膜液的抑菌圈分析

不同濃度的BCp12復(fù)合膜液對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果見(jiàn)圖7和表2。由表2可知，當(dāng)BCp12抗菌肽濃度為0.2-1.0 mg/mL時(shí)，大腸桿菌的抑菌圈平均大小為0.764 cm，BCp12濃度為0.4 mg/mL時(shí)差異顯著（P＜0.05）；當(dāng)BCp12抗菌肽濃度為1.0 mg/mL時(shí)，金黃色葡萄球菌的抑菌圈平均大小為10.26 mm，抑菌效果最好（P＜0.05），而大腸桿菌的抑菌圈直徑為7.78±0.293。同一條件下，抗菌肽BCp12對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果比大腸桿菌抑菌好，這與趙瓊^[40]用MIC法研究BCp12對(duì)兩種致病菌的抑制效果基本一致。而乳扇的食源性致病菌中金黃色葡萄球菌較多，故選1.0 mg/mL為BCp12最佳濃度。

圖7  各組復(fù)合膜液對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果

Fig.7  The bacteriostatic effect of each group of compound membrane solution on Staphylococcus aureus and Escherichia coli

表2  不同濃度的BCp12的復(fù)合膜液對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果

Table.2  The bacteriostatic effect of different concentration of BCp12 compound membrane solution on Staphylococcus aureus and Escherichia coli

注： ^a-e表示同一列內(nèi)不同的差異（P＜0.05）

2.5  復(fù)合膜對(duì)乳扇的保鮮研究

2.5.1  感官評(píng)價(jià)

4個(gè)處理組的感官評(píng)分值在貯藏期內(nèi)都有所下降，其中對(duì)照組的感官評(píng)分值下降較快(見(jiàn)圖8)。這可能是4 ℃下不能完全抑制微生物生長(zhǎng)，且微生物分解的速度足以使乳扇品質(zhì)下降。1組、2組和3組貯藏60 d的感官評(píng)分值變化不大，這是由于乳扇自身的乳酸菌生長(zhǎng)代謝、蛋白和脂肪降解使乳扇的酸味、腐敗味及酒味加重。根據(jù)Pinho^[41]等對(duì)干酪風(fēng)味的研究結(jié)果，干酪的風(fēng)味強(qiáng)度隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)而增加。本實(shí)驗(yàn)也有類(lèi)似的現(xiàn)象，由于蛋白質(zhì)和脂肪的降解使乳扇微觀結(jié)構(gòu)中的孔隙增大和持水性下降，將導(dǎo)致乳扇質(zhì)地變硬^[42]。同時(shí)，1、2、3組的保鮮效果更好，其可能是殼聚糖、酪蛋白、Nisin和BCp12復(fù)合膜可以抑制微生物的生長(zhǎng)及蛋白和脂肪的分解，從而延長(zhǎng)乳扇的貨架期。

2.5.2  過(guò)氧化值的變化

從圖9可知，對(duì)照組在第20 d時(shí)過(guò)氧化值為1.61 mmol/kg，BCp12組在第40 d時(shí)過(guò)氧化值為1.68 mmol/kg，上升趨勢(shì)比較緩慢。BCp12組在60 d內(nèi)過(guò)氧化值變化不明顯，說(shuō)明BCp12起到較好的抗氧化作用。隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，乳扇中過(guò)氧化值逐漸增高，從而形成令人不悅的氣味，其中對(duì)照組的過(guò)氧化值均高于實(shí)驗(yàn)組。這與蘇科巧等^[43]研究結(jié)果類(lèi)似，實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組多一層復(fù)合膜的覆蓋，使乳扇氧化程度較慢，表明其有一定的抗氧化作用。

2.5.3  色差值的變化

由圖10可知，4個(gè)處理組的L^*值均隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，這是由于脂肪被分解產(chǎn)生游離脂肪酸，蛋白質(zhì)在酶和微生物的作用下產(chǎn)生氨基酸和小分子肽，與高鵬飛^[44]研究結(jié)果一致，由于這些油脂蛋白成分的變化會(huì)影響光的反射，從而使L^*值不斷降低。而b^*值逐漸升高，使蛋白質(zhì)變得松軟和坍塌，而松散的蛋白骨架無(wú)法包埋游離脂肪導(dǎo)致脂肪析出，這與田洋^[45]等研究結(jié)果一致，乳扇中的蛋白質(zhì)和脂肪在微生物和內(nèi)源酶的作用下發(fā)生降解，b^*值增加。由此可知，BCp12能抑制乳扇中微生物生長(zhǎng)并降低蛋白質(zhì)水解及油脂析出，使乳扇保持一定的亮度值和黃度值。

2.5.4  菌落總數(shù)的變化

如表3所示，對(duì)照組在前49 d內(nèi)菌落總數(shù)上升，而后呈下降趨勢(shì)，可能是由于乳扇中酵母菌或乳酸菌大量產(chǎn)酸使pH值下降，不耐酸的細(xì)菌大量死亡而造成的。1組、2組和3組都含有殼聚糖且具有抑菌活性，能通過(guò)阻止?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)或穿過(guò)細(xì)菌表面進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，使細(xì)胞正常的代謝活動(dòng)紊亂，從而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。2組和3組乳扇貯藏期間菌落總數(shù)較1組和對(duì)照組少（P＜0.05），說(shuō)明添加BCp12和Nisin能有效抑制微生物繁殖，從而達(dá)到較好的抑菌效果。

表3  乳扇貯藏過(guò)程中菌落總數(shù)變化/CFU·mL^-1（×10⁴）

Table.3  Changes of Colony Total in rushan cheese Storage

注： ^a-d表示同一行內(nèi)不同的差異（P＜0.05）

 3 結(jié)論

本文篩選了一種具有抗菌及保鮮效果的BCp12復(fù)合膜并研究其機(jī)制，且添加BCp12可提高復(fù)合膜的斷裂伸長(zhǎng)率和抗拉強(qiáng)度。對(duì)于復(fù)合膜液的抑菌特性，添加BCp12可顯著提高其抑菌效果，當(dāng)抗菌肽為1 mg/mL時(shí)，復(fù)合膜液對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈分別為10.26 mm和7.78 mm，對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果最佳。微觀結(jié)構(gòu)上，SEM和FT-IR顯示復(fù)合膜有較好的相容性且未出現(xiàn)分層現(xiàn)象以及分子對(duì)接表明BCp12的殘基Y4與酪蛋白、殼聚糖之間存在較強(qiáng)的氫鍵作用。將復(fù)合膜用于乳扇保鮮，能更好的延長(zhǎng)保質(zhì)期。這一研究結(jié)果可為BCp12/殼聚糖/酪蛋白復(fù)合膜用于乳扇保鮮技術(shù)的研究奠定理論基礎(chǔ)。

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