富含共軛亞油酸核桃發(fā)酵乳的研制

柴云美，馬青雯，和怡，許麗珍，黃艾祥^*

云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明  650201

摘要：共軛亞油酸（Conjugated linoleic acid，CLA）是亞油酸的一種異構(gòu)體，具有減肥、抗癌、抗動(dòng)脈粥樣硬化等生理功能。本研究以課題組前期篩選的高產(chǎn)CLA的發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum，L1）為基礎(chǔ)，以核桃油為底物，研發(fā)一款富含CLA的發(fā)酵乳。通過(guò)十字交叉劃線法發(fā)現(xiàn)Lactobacillus fermentum L1與保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus,Lb）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus,St）均不存在拮抗關(guān)系。將添加了不同量核桃仁和核桃油的牛奶按照L1：Lb：St=2:1:1比例發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)核桃油發(fā)酵乳的CLA含量（151.62～215.94μg/mL）均高于核桃仁發(fā)酵乳的CLA含量（76.08～147.99μg/mL）。為進(jìn)一步提高核桃油發(fā)酵乳中CLA含量，通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得到最佳工藝條件（接種量為6%，核桃油添加量為9%，培養(yǎng)溫度為40℃，培養(yǎng)時(shí)間為28h）。最佳工藝條件下制備的發(fā)酵乳感官評(píng)分達(dá)90.35，活菌數(shù)達(dá)lg 8.0 CFU/mL，CLA含量可達(dá)225.56μg/mL，其余各項(xiàng)指標(biāo)良好。本研究為核桃發(fā)酵乳及富含CLA的發(fā)酵食品的研制提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：共軛亞油酸；核桃；發(fā)酵乳

Development of walnut fermented milk rich in conjugated linoleic acid

CHAI Yunmei，MA Qingwen，HE Yi，XU Lizhen，HUANG Aixiang^*

College of Food Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming,Yunnan 650201

Abstract：Conjugated linoleic acid (CLA) is an isomer of linoleic acid, which has physiological functions such as weight loss, anti-cancer, and anti-atherosclerosis. This research is based on the Lactobacillus fermentum (L1), which is high-yielding CLA, selected by the research group in the early stage, and uses walnut oil as a substrate to develop a CLA-rich fermented milk. There is no antagonistic relationship between Lactobacillus fermentum (L1) and Lactobacillus bulgaricus (Lb) and Streptococcus thermophilus (St) by the cross-hatch method. Different amounts of walnut kernels and walnut oil were added to the milk, and fermented according to the ratio of L1:Lb:St=2:1:1. The results of the study found that the CLA content of walnut oil fermented milk (151.62～215.94μg/mL) was higher than that of walnut kernel (76.08～147.99μg/mL).In order to further improve the content of CLA in walnut oil fermented milk, optimal process conditions (the inoculation amount was 6%, the addition amount of walnut oil was 9%, the culture temperature was 40℃and the culture time was 28 h )was obtained by the response surface optimization experiment. The sensory score of fermented milk prepared under the optimal process conditions reached 90.35, the number of viable bacteria reached lg 8.0 CFU/mL, the content of CLA reached 225.56 μg/mL, and the other indicators were good.This research provides a theoretical basis for the development of walnut fermented milk and fermented foods rich in CLA.

Key words: conjugated linoleic acid (CLA); Walnut; Fermented milk

1 前言

發(fā)酵乳因富含蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素、礦物元素、易于消化吸收等特點(diǎn)而深受消費(fèi)者的喜愛(ài)^[1]。隨著生活水平的不斷提高，人們對(duì)食物的需求由最初的“吃得飽”轉(zhuǎn)變?yōu)?/span>“吃得好”，因此功能性食品應(yīng)運(yùn)而生。共軛亞油酸（Conjugated linoleic acids, CLA）作為食物中的天然成分，在奶及奶制品^[2]、肉制品^[3]等食品中被發(fā)現(xiàn)。CLA由于具有抗癌^[4]、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化^[5]、和減肥^[6]等生理功能^[7]，近年來(lái)被作為保健品投放市場(chǎng)，在農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)中應(yīng)用前景廣闊，引起人們的廣泛關(guān)注^[8]。人體自身無(wú)法合成CLA，只有通過(guò)攝取食物來(lái)進(jìn)行補(bǔ)充^[9]。目前人們主要從乳制品和肉制品中獲取CLA，但乳制品和肉制品中CLA的含量較低，無(wú)法滿足人們營(yíng)養(yǎng)健康需求。據(jù)報(bào)道乳酸菌可以大量轉(zhuǎn)化生成CLA^[10],而核桃富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)且亞油酸占不飽和脂肪酸的58%^[11]，以核桃為底物可為未來(lái)大量獲取CLA的一個(gè)重要的途徑^[12]。核桃是云南省的重要種植作物，核桃資源豐富、歷史悠久、栽種地域范圍廣闊。將核桃制作成不同的產(chǎn)品，如核桃乳、核桃油、核桃粉等，可減小農(nóng)產(chǎn)品滯銷(xiāo)帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)，保障農(nóng)民勞動(dòng)成果，增加農(nóng)民的收益^[13]。

本研究以Lactobacillus fermentum L1、Lactobacillus bulgaricus、Streptococcus thermophilus為發(fā)酵劑，核桃仁、核桃油為底物，研制了一款富含CLA的核桃發(fā)酵乳。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1菌種

嗜熱鏈球菌（Streptococcusthermophilus，St），保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus, Lb），發(fā)酵乳桿菌Lactobacillus fermentansL1。

2.1.2 原料與試劑

Man Rogosa Share（MRS）培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基均購(gòu)自Sigma 公司；孟加拉紅培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；核桃油，云南金江綠色產(chǎn)業(yè)有限公司；干核桃，昆明宗澳商貿(mào)有限公司。

2.2 儀器設(shè)備

SW-CJ-IF單人雙面超凈無(wú)菌操作臺(tái), 蘇州江東精密儀司; STB-505榨油機(jī), 上海精密科學(xué)儀器有限公司; TGL2M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī), 長(zhǎng)沙邁佳森儀器設(shè)備有限公司; UV-1800CP紫外分光光度計(jì), 上海美譜達(dá)儀器有限公司。

2.3實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 菌種活化

將保藏于-80℃ 冰箱的L1，St和Lb在MRS瓊脂培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)(37℃, 24h)，從平板上挑取單一菌落至MRS 肉湯培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)24h，活化至第三代備用。

2.3.2 菌種共生關(guān)系研究

在平板上采用十字交叉劃線研究L1， St和Lb間是否存在拮抗關(guān)系。

2.3.3菌種馴化

將活化至第三代的L1，以逐步減少接種量（10%、8%、6%、4%）的方法進(jìn)行逐級(jí)馴化。將傳至第三代的St和Lb，分別與牛奶以1:1的比例混合均勻，于40℃培養(yǎng)至凝乳后即完成馴化。

2.3.3兩種類(lèi)型核桃發(fā)酵乳的制作

2.3.3.1原料乳制備

（1）核桃仁原料乳制備：采用食品級(jí)NaOH在80℃處理5min后進(jìn)行去皮，用小型粉碎機(jī)粉碎并過(guò)100目篩篩分。將核桃顆粒和脫脂乳以3%（g/v）、5%（g/v）、8%（g/v）、10%（g/v）的比例混合后進(jìn)行巴氏滅菌（60～80℃，30min）。

（2）核桃油原料乳制備：將單甘脂、蔗糖脂按照0.3%（g/g）的比例與核桃油混合，用打蛋器攪打制備乳化液。將核桃油乳化液加入脫脂乳中，配制成核桃油含量為3%（g/v）、5%（g/v）、8%（g/v）、10%（g/v）的原料乳。原料乳經(jīng)膠體磨處理三次，每次2min，高壓均質(zhì)機(jī)均質(zhì)三次，壓力為18 MP，均質(zhì)結(jié)束后進(jìn)行巴氏滅菌（60～80℃，30min）。

2.3.3.2發(fā)酵乳制備

將L1: St: Lb=2:1:1比例以2%（v/v）的接種量分別接入滅菌好的核桃仁、核桃油原料乳中，并于37℃下培養(yǎng)24h后放入4℃冰箱中后熟12h。

2.3.3.3發(fā)酵乳CLA含量的測(cè)定

參照朱振元等的方法^[16]，略作調(diào)整，在分液漏斗中加入10mL發(fā)酵乳、30mL水、30 mL正己烷中振蕩萃取，靜置20 min后再加入30 mL正己烷進(jìn)行第二次萃取，其他步驟同上進(jìn)行3次萃取，加入150 ml的水靜置2 h，棄去下層液體，收集上層正己烷層即為萃取液，加入少量無(wú)水硫酸鈉吸水干燥萃取液用0.22 μm濾膜過(guò)濾后移至10 mL的容量瓶，之后用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)。以未接種的發(fā)酵乳為參比，在232 nm（CLA 最大吸收波長(zhǎng)）下測(cè)定萃取液吸光度。并根據(jù)公式y=0.0781x-0.0508（R²=0.9993）計(jì)算CLA含量。

2.3.4單因素試驗(yàn)

以CLA的產(chǎn)量為指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)分別考察接種量（3%、4%、5%、6%、7%）、核桃油添加量（3%、6%、8%、10%）、培養(yǎng)溫度（30 ℃ 、35 ℃ 、38 ℃、40℃、42℃）及培養(yǎng)時(shí)間（20 h、24 h、26 h、28 h、30 h）對(duì)CLA產(chǎn)量的影響。

2.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

綜合產(chǎn)CLA含量的各單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取接種量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間和底物添加量為響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素，分別以A、B、C、D表示，試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，使用Design-Expert軟件進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)。

2.4成品理化指標(biāo)檢測(cè)

參照GB4789.2-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)-菌落總數(shù)測(cè)定》^[14]測(cè)定活菌數(shù)，參照GB 5413.34-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)乳和乳制品酸度測(cè)定》^[15]測(cè)定滴定酸度。

2.5發(fā)酵乳的感官評(píng)價(jià)

感官鑒定發(fā)酵乳，如下表2內(nèi)容，觀察發(fā)酵乳的色澤、質(zhì)地、滋味，同時(shí)留意異味、雜質(zhì)、沉淀等情況。

3 結(jié)果與分析

3.1共培養(yǎng)對(duì)菌種活性的影響

由圖1可知， L1分別與St（左）和Lb（右）交叉劃線后，交叉劃線區(qū)域未出現(xiàn)抑菌現(xiàn)象，說(shuō)明菌種間不存在抑制。研究結(jié)果與張璐^[18]、蔣欣容^[19]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，說(shuō)明菌株可以共同生產(chǎn)發(fā)酵乳。

3.2菌種馴化后凝乳活力

菌種經(jīng)過(guò)馴化后的凝乳情況見(jiàn)表3所示。St和Lb菌種經(jīng)過(guò)在牛奶中馴化后凝乳時(shí)間由6h縮短至了4h，菌落總數(shù)均在lg 7.0 CFU/mL以上，滴定酸度均在70 oT以上，凝乳后有少量的乳清析出；L1經(jīng)馴化后凝乳時(shí)間得到明顯的改善，由未馴化時(shí)的28h凝乳縮短至了6h，菌落總數(shù)均在lg 6.5 CFU/ mL以上，滴定酸度接近70 oT，發(fā)酵凝乳后無(wú)乳清析出。菌株經(jīng)馴化后縮短了凝乳時(shí)間的結(jié)果與李轉(zhuǎn)羽等^[20]的研究相似，說(shuō)明菌株經(jīng)過(guò)馴化后適應(yīng)了在牛奶中的生長(zhǎng)環(huán)境，從而明顯的提高了菌株活力縮短了凝乳時(shí)間。

3.3 兩種類(lèi)型核桃發(fā)酵乳的CLA含量比較

兩種類(lèi)型核桃發(fā)酵乳CLA含量如圖2所示。隨著底物添加量的增加（3%~10%），核桃油發(fā)酵乳與核桃仁發(fā)酵乳的CLA含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，核桃油發(fā)酵乳的CLA含量（151.62～215.94 μg/mL）高于核桃仁的CLA含量（76.08～147.99 μg/mL），當(dāng)添加量為8%時(shí)CLA含量最高。出現(xiàn)這個(gè)結(jié)果的原因可能是亞油酸是乳酸菌產(chǎn)生CLA的底物，據(jù)報(bào)道核桃仁中生成CLA的前體物質(zhì)亞油酸的含量（60.3%）^[21]低于核桃油中的亞油酸的含量（80. 21%）^[22]。故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，以核桃油為底物進(jìn)行研究。

3.4發(fā)酵條件優(yōu)化

3.4.1接種量對(duì)共軛亞油酸含量的影響

菌株不同接種量對(duì)發(fā)酵乳產(chǎn)生CLA含量的影響如圖3所示。隨著接種量的增加（3%~7%），CLA含量呈先增加后減少的趨勢(shì)，接種量為6%時(shí)CLA含量最高（199.64 μg/mL）；接種量高于6%時(shí)，發(fā)酵乳的CLA含量開(kāi)始下降。本試驗(yàn)與于田等^[23]人的試驗(yàn)結(jié)果相一致，原因主要是接種量的多少會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)速度，剛開(kāi)始隨著接種量的增加，菌體生長(zhǎng)旺盛，新陳代謝快，CLA合成量增大。

3.4.2 底物添加量對(duì)共軛亞油酸含量的影響

由圖4可知，底物添加量在3%～8%范圍內(nèi)時(shí)，CLA含量隨著底物添加量的增加而增加。底物添加量為8%時(shí)CLA含量達(dá)到最高（216.15 μg/mL），而高于8%時(shí)CLA含量。本研究結(jié)果與金磊等^[24]的結(jié)果一致，原因主要是異構(gòu)酶異構(gòu)化亞油酸含量，與底物亞油酸添加量有關(guān)，底物添加量少，所以CLA合成就少，隨著底物添加量增加，CLA的合成量也逐漸增大；當(dāng)濃度高于一定值時(shí)，菌株將無(wú)法利用底物，CLA合成減少^[25]。

3.4.3培養(yǎng)溫度對(duì)共軛亞油酸含量的影響

培養(yǎng)溫度對(duì)發(fā)酵乳CLA含量的影響如圖5所示。當(dāng)發(fā)酵溫度為30℃～42℃時(shí)， CLA的合成量呈先增加后減少的趨勢(shì)。溫度為40℃時(shí)CLA產(chǎn)量達(dá)到最高（213.23 μg/mL），當(dāng)溫度高于40℃時(shí)，CLA含量開(kāi)始下降。本研究結(jié)果與張麗莉^[26]的研究結(jié)果一致，菌株發(fā)酵時(shí)溫度過(guò)低，將會(huì)導(dǎo)致菌株出現(xiàn)休眠狀態(tài)；發(fā)酵溫度過(guò)高，導(dǎo)致乳酸菌未進(jìn)行發(fā)酵就死亡。

3.4.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)共軛亞油酸含量的影響

培養(yǎng)時(shí)間對(duì)發(fā)酵乳中的CLA含量的影響如圖6所示。由圖6可知，發(fā)酵乳在培養(yǎng)20 h～28 h時(shí)CLA的含量持續(xù)增高 (85.56 μg/mL～212.06 μg/mL)，培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)28h后CLA開(kāi)始降低。產(chǎn)生此結(jié)果的原因主要是隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，由于共軛雙鍵的不穩(wěn)定性，不飽和脂肪酸最終被還原成飽和或單不飽和脂肪酸^[27]_。

3.5響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件

3.5.1響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，建立Box-Behnken Design中心組合設(shè)計(jì)，Box-Behnken Design中心組合設(shè)計(jì)的原理是以CLA含量為響應(yīng)值，接種量（A）、培養(yǎng)溫度（B）、培養(yǎng)時(shí)間（C）及底物添加量（D）為因素，通過(guò)建立數(shù)學(xué)模型，來(lái)獲得最佳發(fā)酵條件。表4為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果。

3.5.2建立模型及顯著性檢驗(yàn)

利用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)表6進(jìn)行多元回歸擬合，得到的二次方程模型為：Y=+220.89+2.20* A-3.64* B+1.65* C+7.84* D-19.37* A2-13.37* B2-18.32* C2-14.60* D2+2.20* A * B+4.70* A * C-1.47* A * D-1.17* B * C+1.27* B * D+7.87* C * D。回歸模型的方差分析結(jié)果見(jiàn)表5。

由5可知，所建立模型的P＜0.000 1，顯著；失擬項(xiàng)P＞0.05，不顯著，表明模型具有較高可靠性；調(diào)整決定系數(shù)R²=0.9757，信噪比Adeqprecisior=19.948也從另一個(gè)方面表明此模型是可靠的。經(jīng)方差分析，3個(gè)因素對(duì)富含共軛亞油酸核桃發(fā)酵乳影響的主次順序?yàn)?/span>D＞B＞A＞C，即底物添加量＞發(fā)酵溫度＞接種量＞發(fā)酵時(shí)間。

3.5.3響應(yīng)面分析

當(dāng)響應(yīng)面呈現(xiàn)為馬鞍形時(shí)表示交互作用顯著^[28]。如圖7所示，說(shuō)明接種量與培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)時(shí)間與底物添加量之間的交互作用明顯，且對(duì)響應(yīng)值的影響較為顯著，與方差分析結(jié)果有著較好的一致性。

3.5.4最佳發(fā)酵條件的確定和回歸模型的驗(yàn)證

對(duì)回歸方程進(jìn)行逐步回歸，確定最佳工藝參數(shù)：6.05%菌種接種量，39.66℃的發(fā)酵溫度，28.25h的發(fā)酵時(shí)間，8.95%的底物添加量，CLA含量評(píng)分預(yù)測(cè)值為222.42μg/mL。為了切合實(shí)際操作情況，確定發(fā)酵乳最佳發(fā)酵工藝為：6.00%菌種接種量，40.00℃的發(fā)酵溫度，28.00h的發(fā)酵時(shí)間，9.00 %的底物添加量。在上述最佳條件下進(jìn)行驗(yàn)證，得到發(fā)酵乳CLA的最佳含量為225.56 μg/mL，與理論值接近。

3.6富含CLA發(fā)酵乳的品質(zhì)特性

3.6.1理化和微生物指標(biāo)測(cè)定

由表6可知，非脂乳固體（8.73 μg/mL±0.54）、蛋白質(zhì)（3.94±0.20）、酸度（71.81±1.28）的檢出量均符合國(guó)標(biāo)的規(guī)定；大腸菌群、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、酵母和霉菌均未檢出，乳酸菌的活菌數(shù)也符合國(guó)標(biāo)要求，表明產(chǎn)品符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

3.6.2 富含CLA發(fā)酵乳的感官評(píng)價(jià)

如圖8所示，富含共軛亞油酸的酸奶的評(píng)分良好，平均分為90.35；組織狀態(tài)、滋味、風(fēng)味、色澤的平均分分別為27.4、26.95、17.75、18.25。風(fēng)味的感官評(píng)分較低，原因可能是發(fā)酵核桃乳中有機(jī)酸、脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)成分含量的增減在一定程度上會(huì)改變物質(zhì)的香氣成分，與李佳^[29]的研究相似，發(fā)酵后的發(fā)酵乳會(huì)要呈現(xiàn)一定的生味和油脂。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)室篩選的Lactobacillus fermentumL1可與Streptococcusthermophilus和Lactobacillus bulgaricus復(fù)配制作發(fā)酵乳。響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得到最佳工藝，研制出一款色香味俱佳，活菌數(shù)達(dá)為lg 8.0 CFU/mL，CLA含量達(dá)225.56μg/mL的富含CLA的發(fā)酵乳。該發(fā)酵乳的研制豐富了核桃發(fā)酵乳的種類(lèi)，并為富含CLA的發(fā)酵食品的研發(fā)提供了理論依據(jù)。

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