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樣品保存條件對(duì)乳成分、體細(xì)胞和尿素氮的影響

劉琴¹成玉梅²周亞平¹張利坤²李春²施開平²

1. 昆明市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所云南昆明 650041

2. 昆明市奶牛生產(chǎn)性能測(cè)定中心云南昆明 650041

摘要：將6個(gè)添加了防腐劑的牛奶分成兩份，一份保存于常溫，一份保存于4℃，常溫條件下樣品連續(xù)測(cè)定7天，冷藏條件下樣品連續(xù)測(cè)定8天。結(jié)果發(fā)現(xiàn)冷藏條件下牛奶較穩(wěn)定，脂肪、蛋白、乳糖指標(biāo)在常溫保存條件下，最好在四天之內(nèi)測(cè)定完畢，冷藏條件下可保存至少一周；體細(xì)胞在常溫保存條件下樣品最好在3天之內(nèi)檢測(cè)完畢，超過(guò)3天后體細(xì)胞下降達(dá)到10萬(wàn)以上，冷藏條件下可以保存至少一周；測(cè)定尿素氮，由于尿素氮指標(biāo)不穩(wěn)定，不論是常溫或是冷藏最好不要超過(guò)三天。

關(guān)鍵詞：樣品保存， DHI，乳成分、體細(xì)胞、尿素氮、影響

近年來(lái)，我國(guó)奶牛生產(chǎn)性能（DHI）測(cè)定工作不斷得到深入，參測(cè)牛只數(shù)量每年呈上升的趨勢(shì)，一方面是國(guó)家對(duì)該項(xiàng)工作的重視，不斷加大投入；另一方面是奶牛場(chǎng)（奶農(nóng)）對(duì)DHI測(cè)定工作重要性認(rèn)識(shí)不斷加強(qiáng)，自覺(jué)參加測(cè)定。DHI測(cè)定工作的意義不僅體現(xiàn)在全國(guó)層面上的種公牛選育，對(duì)于牛場(chǎng)來(lái)說(shuō)更是為奶牛飼養(yǎng)管理提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐，因此其數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性意義重大。昆明市自2009年開始DHI測(cè)定工作以來(lái)，已累計(jì)參測(cè)奶牛3萬(wàn)余頭，成效比較顯著。但是由于牛場(chǎng)分布較廣，送樣時(shí)間較長(zhǎng)，為探討牛奶保存時(shí)間對(duì)DHI測(cè)定結(jié)果的影響，為DHI采樣工作提供依據(jù)，昆明市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所及昆明市奶牛奶業(yè)協(xié)會(huì)通過(guò)樣品在常溫和冷藏條件下連續(xù)測(cè)定，研究不同保存條件和時(shí)間對(duì)DHI測(cè)定結(jié)果的影響�，F(xiàn)將其報(bào)道如下。

1. 儀器和材料

1.1 儀器：CombiFoss™ FT+牛奶體細(xì)胞成分聯(lián)機(jī)分析儀，水浴鍋（北京中興）。

1.2 樣品：在昆明市晉寧縣6個(gè)奶牛場(chǎng)共采集6份樣品，每份樣品1000ml，加入防腐劑（按每50ml加入1粒專用防腐劑，其主要成分溴硝基丙二醇）。樣品采集后分成兩份，一份存于4℃，一份存于常溫。測(cè)定前水浴至42℃。分別檢測(cè)脂肪、蛋白、乳糖、體細(xì)胞、尿素氮，連續(xù)測(cè)定7-8天。

2. 方法

2.1 儀器校準(zhǔn)：脂肪、蛋白、乳糖用奶牛全國(guó)畜牧總站DHI標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備實(shí)驗(yàn)室提供的標(biāo)準(zhǔn)品定標(biāo)，每月一次定標(biāo)。每次檢測(cè)前用清洗調(diào)零，并用校核樣檢測(cè)。體細(xì)胞用FOSS公司的FMA校核，尿素氮自校準(zhǔn)。

2.2 樣品測(cè)定：樣品42℃水浴加熱25-30min，測(cè)定脂肪、蛋白、乳糖、體細(xì)胞、尿素氮5個(gè)指標(biāo)。常溫保存測(cè)定連續(xù)7天，冷藏保存連續(xù)測(cè)定8天。

2.3 數(shù)據(jù)分析用EXCEL 2007 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用SPSS 16.0 進(jìn)行配對(duì)T檢驗(yàn)，0.05為顯著性判定標(biāo)準(zhǔn)。

3. 結(jié)果

3.1 對(duì)脂肪的影響

常溫和冷藏對(duì)脂肪的影響不明顯。六個(gè)樣品連續(xù)一周測(cè)定的值見表1、2。連續(xù)測(cè)定值與第一天測(cè)定結(jié)果的T值見表3。從表3可以看出，兩種保存條件連續(xù)一周測(cè)定結(jié)果與第一天的T值均大于0.05，差異不顯著。常溫條件下，脂肪的變化幅度較大，6個(gè)樣品的連續(xù)測(cè)定，與第一天的差值平均值從0.06至-0.03，而冷藏條件下，連續(xù)測(cè)定8天，與第一天的差值都在0.02，差異很小。

3.2 對(duì)蛋白的影響

保存方式對(duì)蛋白的影響見表4、5，T值見表6，常溫保存條件下，T值均大于0.5，但檢測(cè)值絕對(duì)差較大，如第1號(hào)樣品在第七天差值達(dá)到0.09，第4號(hào)樣品在第六天差值較大的達(dá)到0.23。而在冷藏條件下，第四天、第六天的結(jié)果與第一天有顯著差異，T值分別為0.025和0.01，而其他日期的T值均大于0.5，但絕對(duì)差值較小，均在0.03以內(nèi)。常溫保存條件下，在第四天之內(nèi)6個(gè)樣品平均變化均在0.03以內(nèi)，而在第五天之后，樣品平均變化超過(guò)了0.04。

表4 常溫保存溫度對(duì)蛋白的影響單位：%

樣品	第一天	第二天	第三天	第四天	第五天	第六天	第七天
1	2.99	2.98	2.98	3	3.04	3.01	3.08
2	3	3	2.97	2.99	3.05	2.98	2.99
3	3.14	3.13	3.12	3.13	3.16	3.07	3.11
4	2.76	2.81	2.86	2.92	2.97	2.99	未測(cè)
5	3.05	3.07	3.07	3.09	3.09	3.11	3.05
6	3.23	3.21	3.23	3.24	3.23	3.25	3.2
絕對(duì)差均值		0.01	0.01	0.03	0.06	0.04	0.06

表5 冷藏對(duì)蛋白的影響單位：%

樣品	第一天	第二天	第三天	第四天	第五天	第六天	第七天	第八天
1	2.99	2.98	2.98	3.02	3	3.03	2.98	2.98
2	3	2.99	2.97	3.01	3	3.02	2.96	2.98
3	3.14	3.14	3.11	3.15	3.15	3.16	3.12	3.14
4	2.76	2.76	2.74	2.77	2.79	2.8	2.77	2.77
5	3.05	3.06	3.08	3.07	3.05	3.09	3.05	3.05
6	3.23	3.24	3.25	3.23	3.21	3.25	3.23	3.23
絕對(duì)差均值		0.00	-0.01	0.01	0.01	0.03	-0.01	0.00

3.3 對(duì)乳糖的影響

保存方式對(duì)乳糖的影響見表7、8，T值見表9。常溫保存條件下，T值均大于0.5，差異不顯著。但從數(shù)值上來(lái)看，乳糖差異較大，乳糖有降低的趨勢(shì)。如1號(hào)樣品第一天第三天相差0.06，與第七天相差達(dá)到0.14，而第4號(hào)樣品第1天與第二天相差達(dá)到0.1，與第六天差異達(dá)到0.45，可能與樣品本身有關(guān)。在冷藏條件下，差值較小，連續(xù)測(cè)定6個(gè)樣品平均變化值都在均在0.02以內(nèi)。說(shuō)明冷藏條件下，乳糖值較穩(wěn)定。

表7 常溫對(duì)乳糖的影響單位：%

樣品	第一天	第二天	第三天	第四天	第五天	第六天	第七天
1	4.74	4.71	4.68	4.72	4.69	4.62	4.6
2	4.68	4.68	4.67	4.68	4.69	4.64	4.66
3	4.62	4.62	4.61	4.63	4.63	4.52	4.58
4	4.53	4.43	4.35	4.34	4.23	4.08	未測(cè)
5	4.78	4.81	4.82	4.83	4.84	4.79	4.8
6	4.85	4.81	4.87	4.87	4.84	4.83	4.82
絕對(duì)差均值		-0.02	-0.03	-0.02	-0.05	-0.12	-0.01

表8 冷藏對(duì)乳糖的影響單位：%

樣品	第一天	第二天	第三天	第四天	第五天	第六天	第七天	第八天
1	4.74	4.74	4.72	4.78	4.72	4.72	4.71	4.75
2	4.68	4.69	4.63	4.73	4.67	4.67	4.64	4.69
3	4.62	4.63	4.59	4.64	4.64	4.6	4.61	4.64
4	4.53	4.52	4.47	4.55	4.56	4.49	4.53	4.52
5	4.78	4.8	4.83	4.84	4.8	4.79	4.78	4.83
6	4.85	4.86	4.87	4.87	4.83	4.83	4.86	4.87
絕對(duì)差均值		0.01	-0.01	0.04	0.00	-0.02	-0.01	0.02

3.4 對(duì)體細(xì)胞的影響

保存條件對(duì)體細(xì)胞的影響較大，結(jié)果見表10 、11，T值見表12。常溫條件下，在第三天之內(nèi)，6個(gè)樣品的體細(xì)胞變化平均值在10萬(wàn)以內(nèi)，在第四天以后，6個(gè)樣品變化平均值超過(guò)10萬(wàn)，在第五天后，體細(xì)胞數(shù)與第一天的結(jié)果差異極顯著（T值小于0.05），體細(xì)胞隨保存時(shí)間延長(zhǎng)持續(xù)下降，在第七天時(shí)下降幅度接近50%，見圖1。而在冷藏條件下，體細(xì)胞相對(duì)穩(wěn)定，在實(shí)驗(yàn)期內(nèi)T值均大于0.05，差異不顯著，連續(xù)測(cè)定八天絕對(duì)差值都在15萬(wàn)/mL以內(nèi)，6個(gè)樣品絕對(duì)差均值在4萬(wàn)以內(nèi)。

表 10 常溫對(duì)體細(xì)胞的影響單位：萬(wàn)/mL

樣品	第一天	第二天	第三天	第四天	第五天	第六天	第七天
1	155	149	121	100	85	80	68
2	145	133	115	109	96	86	80
3	130	134	127	123	115	110	103
4	62	68	63	65	61	54	未測(cè)
5	70	78	61	55	52	45	39
6	161	197	180	161	149	140	144
絕對(duì)差均值		6	-9	-18	-28	-35	-34

表 11 冷藏對(duì)體細(xì)胞的影響單位：萬(wàn)/mL

樣品	第一天	第二天	第三天	第四天	第五天	第六天	第七天	第八天
1	155	170	158	148	153	156	137	140
2	145	147	138	142	147	148	137	137
3	130	150	137	143	146	141	143	139
4	62	62	58	60	57	60	58	51
5	70	68	69	69	74	71	68	71
6	161	160	163	163	158	165	160	161
絕對(duì)差均值		6	0	0	2	3	-3	-4.00

3.5 對(duì)尿素氮的影響

保存方式對(duì)尿素氮的影響見表13、14，T值見表15。常溫條件下，T值均大于0.05，差異不顯著，但是尿素氮值忽高忽低，差異較大（1號(hào)和5號(hào)樣品第一天和第三天差異已經(jīng)達(dá)到1.4，6號(hào)樣品第一天和第三天的差異達(dá)到2.5）。而冷藏條件下，第一天和第四天，第一天和第七天T值小于0.05，差異顯著，但規(guī)律性不強(qiáng)�？傮w上來(lái)說(shuō)，不論是常溫或是冷藏，尿素氮指標(biāo)值不穩(wěn)定，采樣后要及時(shí)檢測(cè)。

表13 常溫對(duì)尿素氮的影響單位：mg/100mL

樣品	第一天	第二天	第三天	第四天	第五天	第六天	第七天
1	5.7	5.6	4.3	7.2	5.3	1.8	0
2	8.2	6.9	9.9	9.3	9	9.4	10.1
3	6.8	6.9	9.4	8.9	10.5	11.4	12.9
4	2.6	0.8	0	0	0	0	未測(cè)
5	6.3	6.8	7.6	8.7	6.3	7.4	8.6
6	7.8	8.9	10.3	9.1	9.6	10.2	10.8
絕對(duì)差均值		-0.2	0.7	1.0	0.6	0.5	2.3

表14 冷藏對(duì)尿素氮的影響單位：mg/100mL

樣品	第一天	第二天	第三天	第四天	第五天	第六天	第七天	第八天
1	5.7	5.3	6.9	7.4	6.1	6.5	5.9	8.1
2	8.2	8.5	7	8.4	8.1	7.4	9.1	10.3
3	6.8	5.9	7	7.6	7.1	6.7	6.9	9.1
4	2.6	3.6	3.7	3.6	2.7	4.4	3.8	4.3
5	6.3	6.7	7.4	6.6	6.5	7	6.8	7.9
6	7.8	8.9	8.3	7.8	8.5	8.5	8.2	9.5
絕對(duì)差均值		0.3	0.5	0.7	0.3	0.5	0.6	2.0

圖2 保存方式對(duì)尿素氮的影響

4. 討論

4.1 脂肪：常溫保存時(shí)，第二天脂肪結(jié)果升高，6個(gè)樣品平均差異達(dá)到0.06，然后檢測(cè)值又逐漸下降，規(guī)律性不強(qiáng)，差異不顯著，可能是樣品本身的問(wèn)題。冷藏對(duì)脂肪的影響不大，保存一周之內(nèi)對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響在0.03之內(nèi)。

4.2 蛋白：常溫保存情況下，連續(xù)測(cè)定七次，與第一天的T值都在0.05以上，常溫保存時(shí)，蛋白質(zhì)在第五天6個(gè)樣品的差異平均值達(dá)到0.06，說(shuō)明保存期超過(guò)第五天以上時(shí)，差異較大。而冷藏保存條件下，第四天、第六天的結(jié)果與第一天有顯著差異，T值分別為0.025和0.01，但考慮第五天、第七、八天的差異不顯著，連續(xù)測(cè)定8天差異平均差異都在0.03以內(nèi)，說(shuō)明差異可以忽略不計(jì)。

4.3 乳糖：常溫保存時(shí)，連續(xù)測(cè)定七天T值都在0.05以上，但是第五天之后6個(gè)樣品差異平均值達(dá)到0.05。而冷藏保存條件下，雖然在第三天時(shí)，差異極顯著，但隨后的幾天內(nèi)，T值均大于0.05，連續(xù)測(cè)定8天6個(gè)樣品平均差異都在0.02以內(nèi)，說(shuō)明差異來(lái)自于樣品本本身。

4.4 體細(xì)胞：常溫保存時(shí)，在第二、三天，體細(xì)胞差異都在10萬(wàn)以內(nèi)，在第四天后，6個(gè)樣品差異平均值都在10萬(wàn)/mL以上，且在第五天后體細(xì)胞與第一天的T值都小于0.05，說(shuō)明體細(xì)胞變化顯著。而冷藏條件下，連續(xù)測(cè)定8天6個(gè)樣品平均變化都在5萬(wàn)以內(nèi)，說(shuō)明冷藏條件下可以保存一周以上。

4.5 尿素氮：不論是常溫或冷藏，尿素氮測(cè)定值不穩(wěn)定，規(guī)律性不強(qiáng)，忽高忽低，原因尚不明確。常溫條件下，保存至第七天，尿素氮平均變化超過(guò)2.0，冷藏條件下，保存至第八天，尿素氮變化也超過(guò)2.0。

5 結(jié)論

5.1常溫保存樣品穩(wěn)定性不如冷藏條件，因此樣品采集后盡量冷藏保存。檢測(cè)脂肪、蛋白、乳糖時(shí)，如果常溫保存，最好在第四天之內(nèi)測(cè)定，如果需要長(zhǎng)途運(yùn)輸要有冷鏈措施。冷藏條件下至少可以保存8天以上。

5.2 測(cè)定體細(xì)胞時(shí)，常溫對(duì)體細(xì)胞的影響比較大，隨時(shí)間延長(zhǎng)，體細(xì)胞數(shù)下降，冷藏條件下也如此，但下降幅度較小。檢測(cè)體細(xì)胞時(shí)，常溫保存樣品要在3天之內(nèi)檢測(cè)，冷藏條件下可以保存至少一周。

5.3 測(cè)定尿素氮時(shí)，由于其很不穩(wěn)定，樣品采集以后最好能在第二天內(nèi)測(cè)定完畢。超過(guò)3天，尿素氮指標(biāo)變化可能會(huì)較大，導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。