PCR定性篩選檢測方法

　　1996年德國伯恩斯坦大學的MeyerRolf等論證了PCR檢測轉(zhuǎn)基因食品的可能性，植物細胞轉(zhuǎn)入的基因成分一般包括啟動子(promotor)、報告基因(reportergene)、目的基因(targetgene)和終止子(terminator)，其中啟動子和終止子為表達目的基因所必需。目前，轉(zhuǎn)基因植物所采用的啟動子主要為來源于花椰菜花葉病毒的Camv35s啟動子、根瘤農(nóng)桿菌的nos啟動子及玄參花葉病毒的FMV35s啟動子；廣泛應(yīng)用的終止子分別來源于根瘤農(nóng)桿菌的nos終止子、花椰菜花葉病毒的camv終止子以及新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶NptII終止子。針對這些基因的PCR擴增可涵蓋95％的現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因植物的需要。

　　PCR定性檢測是高靈敏度的DNA水平檢測，但常伴有各種假性結(jié)果出現(xiàn)：(1)DNA提取時產(chǎn)生的各種反應(yīng)抑制因子，使PCR呈假陰性；(2)產(chǎn)品深加工時核酸被破壞成碎片，含量極低，使PCR呈假陰性；(3)當作物受到花椰菜花葉病毒的感染而帶有35S啟動子或因農(nóng)桿菌感染而帶有nos終止子時，PCR呈假陽性；(4)實驗室的殘留污染使檢測結(jié)果呈假陽性；(5)在收獲、運輸或加工過程中轉(zhuǎn)基因食品與非轉(zhuǎn)基因食品產(chǎn)生交叉污染也會使檢測結(jié)果不準確。

　　要防止檢測出現(xiàn)假陰性結(jié)果，必須在檢測過程中嚴格遵守操作規(guī)程，優(yōu)化PCR條件，在DNA提取過程中盡量去除可能抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)，并可通過擴增真核生物的18SrRNA基因來消除假陰性；要消除轉(zhuǎn)基因食品檢測中假陽性結(jié)果的影響，可采用southern雜交、PCR產(chǎn)物純化測序或PCR擴增產(chǎn)物酶切分析等方法，對樣品同時檢測其Camv35s和nos基因雙元件，可避免某些作物因自然感染花椰菜花葉病毒或根癌農(nóng)桿菌產(chǎn)生的假陽性結(jié)果。

　　實時熒光定量PCR法

　　實時熒光PCR技術(shù)于1996年由美國AppliedBiosystems公司推出，是指在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上添加了一條標記了兩個熒光基團的探針，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量的方法。目前我們應(yīng)用于實時定量PCR檢測體系中的熒光探針主要有3種：分子信標探針，TaqMan探針和雜交雙探針。

　　實時定量PCR檢測的靈敏度至少是競爭PCR的10倍，它可以檢測到每克樣品中含2pg轉(zhuǎn)基因的DNA量。對加工、未加工和混合樣品都可以進行檢測。

　　實時熒光PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，可對整個PCR進程的實時監(jiān)測。此外，實時熒光PCR采用閉管分析，無需電泳等PCR后處理步驟，能有效消除核酸的交叉污染。由于在PCR反應(yīng)體系中加入熒光探針，使得非特異性產(chǎn)物不能與探針雜交，尤其對與特異性產(chǎn)物分子量接近、通過電泳無法分開的產(chǎn)物更為有效。當前此方法的挑戰(zhàn)就是定量標準物的滯后發(fā)展，商業(yè)化的標準物已不能滿足日漸增長的轉(zhuǎn)基因檢測需要。Moreano等以轉(zhuǎn)基因油菜籽為檢測目標發(fā)展出了一種新型標準物的合成方法，從而為提高熒光定量檢測的標準化程度指明了方向。

　　基因芯片檢測法

　　當今應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因食品檢測的前沿技術(shù)當屬基因芯片技術(shù)，其實質(zhì)就是高度集成化的反向斑點雜交技術(shù)。探針分子固定在載體上，待測基因經(jīng)過PCR、末端標記等操作，成為標記有熒光染料或同位素的核酸分子，然后與固定的探針雜交。依據(jù)標記方法的不同，通過放射自顯影、激光共聚焦顯微鏡或CCD相機讀出每個斑點信號的強度，計算機對雜交信號進行處理，得到雜交譜。該技術(shù)是20世紀90年代由美國的Affymetrix公司首先發(fā)展起來的，該公司曾在1996年制造出世界上第一塊商品化基因芯片。

　　免疫學和PCR檢測技術(shù)大部分情況下一次實驗只能檢測1種目標分子，在少數(shù)情況下能同時檢測2～3種目標分子。基因芯片能解決大數(shù)量基因檢測問題，具有靈敏度高、效率高、成本低、自動化、結(jié)果明確等優(yōu)點。但由于其應(yīng)用需要的相應(yīng)設(shè)備造價高，普及范圍窄，而且目前沒有形成任何標準，使得基因芯片檢測法應(yīng)用范圍不廣。

　　多重連接依賴的探針擴增(MLPA)

　　此方法是轉(zhuǎn)基因多重定量檢測的最新進展，最初是由荷蘭的Dr．SchoutenJP于2002年發(fā)表的應(yīng)用于醫(yī)學檢測目的高度靈敏的相對定量技術(shù)。它是利用簡單的雜交、連接、PCR擴增反應(yīng)，于單一反應(yīng)管內(nèi)同時檢測最多40個不同的核苷酸序列的拷貝數(shù)變化。

　　MLPA方法是針對不同檢測序列設(shè)計多組專一的探針組，對探針組進行擴增的檢測方法。每組探針組總長度不同，可與目標序列雜交黏合。所有探針的5′端都有通用引物結(jié)合區(qū)PBS(primerbindingsites)，3′端都有與待擴增目標序列結(jié)合區(qū)，在PBS區(qū)與目標序列結(jié)合區(qū)之間插入不同長度的寡核苷酸，由此形成長度不一的探針組。如果目標序列缺失、產(chǎn)生突變或是由于不同探針組的配對，則這組探針無法成功連接，也沒有相應(yīng)的擴增反應(yīng)。如果這組探針可與目標序列完全黏合，則連接酶會將這組探針連接成為一個片段，并通過標記的通用引物對此連接在一起的探針組進行擴增。最終經(jīng)過毛細管電泳和激光誘導(dǎo)的熒光來檢測擴增產(chǎn)物。

　　FranciscoMoreano等應(yīng)用此方法檢測了標準的轉(zhuǎn)基因大豆和玉米并經(jīng)過特異性和敏感性實驗驗證了MLPA在轉(zhuǎn)基因檢測中的可行性。實驗表明，當探針與目標序列結(jié)合的片段長度越長，檢測的敏感性就增加，并且根據(jù)轉(zhuǎn)基因序列擴增強度與內(nèi)參基因擴增強度的比值和轉(zhuǎn)基因含量之間的線性關(guān)系，可以對待檢樣品進行定量分析。